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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Este protocolo descreve uma metodologia para isolar e identificar células-tronco mesenquimais (CTMs) derivadas do tecido adiposo de ratos Sprague Dawley.

Abstract

As células mesenquimais adultas revolucionaram a biologia molecular e celular nas últimas décadas. Podem diferenciar-se em diferentes tipos celulares especializados, além de sua grande capacidade de auto-renovação, migração e proliferação. O tecido adiposo é uma das fontes menos invasivas e mais acessíveis de células mesenquimais. Também tem sido relatado para ter rendimentos mais elevados em comparação com outras fontes, bem como propriedades imunomoduladoras superiores. Recentemente, diferentes procedimentos para obtenção de células mesenquimais adultas de diferentes fontes teciduais e espécies animais têm sido publicados. Após avaliação dos critérios de alguns autores, padronizamos uma metodologia aplicável a diferentes propósitos e facilmente reprodutível. Um pool de fração vascular estromal (FVS) do tecido adiposo perirrenal e epididimal nos permitiu desenvolver culturas primárias com morfologia e funcionalidade ideais. As células foram observadas aderidas à superfície plástica por 24 h e exibiram morfologia semelhante a fibroblastos, com prolongamentos e tendência a formar colônias. As técnicas de citometria de fluxo (CF) e imunofluorescência (IF) foram utilizadas para avaliar a expressão dos marcadores de membrana CD105, CD9, CD63, CD31 e CD34. A capacidade das células-tronco derivadas do tecido adiposo (CTAs) de se diferenciar na linhagem adipogênica também foi avaliada usando um coquetel de fatores (4 μM de insulina, 0,5 mM de 3-metil-iso-butil-xantina e 1 μM de dexametasona). Após 48 h, observou-se perda gradual da morfologia fibroblastóide e, aos 12 dias, confirmou-se a presença de gotículas lipídicas positivas para coloração vermelho oleoso. Em resumo, propõe-se um procedimento para obtenção de culturas de ASC ótimas e funcionais para aplicação em medicina regenerativa.

Introduction

As células-tronco mesenquimais (CTMs) têm forte impacto na medicina regenerativa devido à sua alta capacidade de auto-renovação, proliferação, migração e diferenciação em diferentes linhagens celulares 1,2. Atualmente, uma grande quantidade de pesquisas está se concentrando em seu potencial para o tratamento e diagnóstico de várias doenças.

Existem diferentes fontes de células mesenquimais: medula óssea, músculo esquelético, líquido amniótico, folículos pilosos, placenta, tecido adiposo, entre outros. São obtidos de diferentes espécies, incluindo humanos, camundongos, ratos, cães e ....

Protocol

Todos os procedimentos experimentais foram realizados seguindo as Diretrizes Mexicanas para Cuidados com Animais, baseadas nas recomendações da Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, México). O protocolo foi revisado, aprovado e registrado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Saúde do Instituto Mexicano del Seguro Social (R-2021-785-092).

1. Remoção de tecido adiposo de ratos por ressecção ci.......

Representative Results

O tecido adiposo foi obtido de ratos adultos da raça Sprague Dawley, com idade entre 3 e 4 meses de idade e peso corporal de 401 ± 41 g (média geométrica ± DP). O valor médio de 3,8 g de tecido adiposo epididimal e perirrenal correspondeu à análise de 15 extrações experimentais. Após 24 h de cultivo, as populações celulares permaneceram aderidas à superfície plástica e exibiram morfologia heterogênea. A primeira passagem foi realizada aos 8 ± 2 dias, com rendimento de 1,4 ± 0,6 x10,6 célula.......

Discussion

Nas últimas quatro décadas, desde a descoberta das CTMs, vários grupos de pesquisadores descreveram procedimentos para a obtenção de CTMs de diferentes tecidos e espécies. Uma das vantagens do uso de ratos como modelo animal é a sua fácil manutenção e rápido desenvolvimento, bem como a facilidade de obtenção de CTMs a partir do tecido adiposo. Diferentes fontes teciduais têm sido descritas para a obtenção de CTAs, como gordura visceral, perirrenal, epididimal e subcutânea12,13,14,15,16........

Acknowledgements

Os autores agradecem ao Instituto Mexicano de Seguridade Social (IMSS) e ao Hospital Infantil do México, Federico Gomez (HIMFG) e à equipe de Biotério da Coordenação de Pesquisa do IMSS, pelo apoio dado para a realização deste projeto. Agradecemos ao Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia pela bolsa AOC (815290) e a Antonio Duarte Reyes pelo apoio técnico no material audiovisual.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Amphotericin BHyCloneSV30078.01
Analytical balanceSartoriusAX224
Antibody anti- CD9 (C-4)Santa CruzSc-13118
Antibody anti-CD34 (C-18)Santa CruzSc-7045
Antibody anti-C63Santa CruzSc-5275
Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 Santa CruzSc-18838A594
Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680Santa CruzSc-18916AF680
Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 NovusNB 120-6939
Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 InvitrogenSA5-10087
Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´)RD Systems.No. F103B
Bottle Top Filter SterileCORNING10718003
Cell and Tissue Culture FlasksBIOFIL170718-312B
Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slidesSIGMA Aldrich Z359629
Cell wells: 6 well with LidCORNING25810
Centrifuge conical tubesHeTTICHROTANA460R
Centrifuge eppendorf tubesFischer ScientificM0018242_44797
Collagen IV WorthingtonLS004186
CryovialSPL Life Science43112
Culture tubesGreiner Bio-One 191180
CytExpert 2.0Beckman CoulterFree version
CytoFlex LX cytometerBeckman CoulterFLOW-2463VID03.17
DMEMGIBCO31600-034
DMSOSIGMA Aldrich 67-68-5
DraQ7 DyeThermo Sc. D15106
EDTASIGMA Aldrich60-00-4
Eosin yellowishHycel300
Ethanol 96%Baker64-17-5
Falcon tubes 15 mLGreiner Bio-One 188271
Falcon tubes 50 mLGreiner Bio-One 227261
Fetal Bovine Serum CORNING35-010-CV
GelatinSIGMA Aldrich128111163
GentamicinGIBCO15750045
Glycerin-High PurityHerschi Trading 56-81-5
HematoxylinAMRESCO 0701-25G
Heracell 240i CO2 Incubator Thermo Sc.50116047
Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate)ArandaSV057430
L-Glutamine GIBCO/ Thermo Sc. 25030-081
LSM software Zen 2009 V5.5Free version
Biological Safety Cabinet Class IINuAire12082100801
Epifluorescent microscope Zeiss Axiovert 100M21.0028.001
Inverted microscope Olympus CK40CK40-G100
Non-essential amino acids 100XGIBCO11140050
Micro tubes 2 mL Sarstedt 72695400
Micro tubes 1,5 mLSarstedt 72706400
Micropipettes 0.2-2 μLFinnpipetteE97743
Micropipettes 2-20 μLFinnpipetteF54167
Micropipettes 20-200 μLFinnpipetteG32419
Micropipettes 100-1000 μLFinnpipetteFJ39895
Nitrogen tank liquidTaylor-Wharton681-021-06
ParaformaldehydeSIGMA AldrichSLBC3029V
Penicillin / Streptomycin GIBCO/ Thermo Sc. 15140122
Petri dish Cell cultureCORNING Inc480167
Pipet TipsAxygen Scientific301-03-201
Pisabental (pentobarbital sodium)PISA AgropecuariaQ-7833-215
Potassium chloride J.T.Baker7447-40-7
Potassium Phosphate DibasicJ.T Baker2139900
S1 Pipette FillersThermo Sc9531
Serological pipette 5 mLPYREXL010005
Serological pipette 10 mLPYREXL010010
Sodium bicarbonateJ.T Baker144-55-8
Sodium chloride J.T.Baker15368426
Sodium Phosphate Dibasic AnhydrousJ.T Baker7558-79-4
Sodium pyruvateGIBCO BRL11840-048
Syringe Filter SterileCORNING431222
SpectrophotometerPerkinElmer Lambda 25L6020060
Titer plate shakerLAB-LINE1250
Transfer pipetsSamco/Thermo Sc728NL
Trypan Blue stainGIBCO1198566
Trypsin From Porcine PancreasSIGMA Aldrich102H0234
Tween 20SIGMA Aldrich9005-64-5
Universal Blocking Reagent 10xBioGenexHK085-GP
Xilapet 2% (xylazine hydrochloride)Pet's PharmaQ-7972-025

References

  1. Djian, P., Roncari, A. K., Hollenberg, C. H. Influence of \anatomic site and age on the replication and differentiation of rat adipocyte precursors in culture. The Journal of Clinical Investigation. 72 (4), 1200-1208 (1983).
  2. Greenwood, M. R., Hirsch, J.

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