A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
אלקטרופורציה של אורגנואידים מוחיים של פרימטים מספקת גישה מדויקת ויעילה להחדרת שינויים גנטיים חולפים לסוגי אבות ונוירונים שונים במערכת מודל הקרובה להתפתחות ניאו-קורטקס פיזיולוגי של פרימטים (פתו). זה מאפשר את המחקר של תהליכים נוירו-התפתחותיים ואבולוציוניים והוא יכול להיות מיושם גם עבור מודלים המחלה.
קליפת המוח היא מבנה המוח החיצוני ביותר והיא אחראית על עיבוד הקלט החושי והפלט המוטורי; הוא נתפס כמקום מושבן של יכולות קוגניטיביות מסדר גבוה יותר אצל יונקים, במיוחד פרימטים. חקר תפקודי גנים במוחות של פרימטים הוא מאתגר מסיבות טכניות ואתיות, אך הקמת טכנולוגיית אורגנואיד המוח אפשרה לחקור את התפתחות המוח במודלים מסורתיים של פרימטים (למשל, מקוק רזוס ומרמוסט מצוי), כמו גם במינים של פרימטים שלא היו נגישים בעבר בניסוי (למשל, קופי אדם גדולים), במערכת מוצדקת מבחינה אתית ופחות תובענית מבחינה טכנית. יתר על כן, אורגנואידים במוח האנושי מאפשרים חקירה מתקדמת של הפרעות נוירו-התפתחותיות ונוירולוגיות.
מאחר שאורגנואידים במוח משחזרים תהליכים רבים של התפתחות המוח, הם גם מהווים כלי רב-עוצמה לזיהוי הבדלים ולהשוואה תפקודית בין הגורמים הגנטיים העומדים בבסיס התפתחות המוח של מינים שונים בהקשר אבולוציוני. יתרון גדול של שימוש באורגנואידים הוא האפשרות להכניס שינויים גנטיים, המאפשרים בדיקה של תפקודי גנים. עם זאת, המבוא של שינויים כאלה הוא מייגע ויקר. מאמר זה מתאר גישה מהירה וחסכונית לשינוי גנטי של אוכלוסיות תאים בתוך מבנים דמויי חדרים של אורגנואידים מוחיים של פרימטים, תת-סוג של אורגנואידים במוח. שיטה זו משלבת פרוטוקול שונה לייצור אמין של אורגנואידים מוחיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) שמקורם במרמוסט ונפוצים שמקורם במרמוסט עם גישת מיקרו-הזרקה ואלקטרופורציה. זה מספק כלי יעיל לחקר תהליכים נוירו-התפתחותיים ואבולוציוניים שניתן ליישם גם עבור מודלים של מחלות.
חקירת ההתפתחות והאבולוציה הפיזיולוגית (הפתולוגית) של קליפת המוח היא משימה אימתנית שמתעכבת על ידי היעדר מערכות מודל מתאימות. בעבר, מחקרים כאלה היו מוגבלים למודלים דו-ממדיים של תרביות תאים (כגון אב עצבי ראשוני או תרביות תאים עצביים) ולמודלים אבולוציוניים רחוקים של בעלי חיים (כגון מכרסמים)1,2. בעוד מודלים אלה שימושיים להתמודדות עם שאלות מסוימות, הם מוגבלים במידול המורכבות, הרכב סוג התא, הארכיטקטורה התאית ודפוסי ביטוי הגנים של הניאוקורטקס האנושי המתפתח במצבים בריאים וחולים. מגבלות אלה מובילות, למשל, ליכולת תרגום ירודה של מודלים עכבריים של מחלות אנושיות למצב האנושי, כפי שמתואר במקרים מסוימים של מיקרוצפליה (למשל, Zh....
1. תרבית של פרימטים מושרים
הערה: בשל החוסן שלה, השיטה המוצגת כאן יכולה להיות מיושמת על כל קו iPSC פרימטים. במאמר זה אנו מתארים ייצור אורגנואידים מוחיים מקווי iPSC אנושיים (iLonza2.2)29, שימפנזים (Sandra A)30, מקוק רזוס (iRh33.1)29 ומרמוסט מצוי (cj_160419_5)31
הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר יצירה יעילה של אורגנואידים מוחיים מקווי iPSC אנושיים, שימפנזים, רזוס מקוק ומרמוסט מצוי עם שינויי תזמון מינימליים הנדרשים בין מינים שונים (איור 1A). אורגנואידים אלה יכולים להתחשמל בטווח של 20 dps עד 50 dps, בהתאם לנגישות של מבנים דמויי חדרים ואת שפע של אוכ?.......
ההליכים המתוארים כאן מייצגים פרוטוקול אחיד ליצירת אורגנואידים מוחיים ממיני פרימטים שונים עם גישת אלקטרופורציה ממוקדת. זה מאפשר ביטוי חוץ רחמי של GOI במערכת מודל המדמה התפתחות ניאו-קורטקס פיזיולוגית של פרימטים (כולל בני אדם) (פתו). פרוטוקול מאוחד זה ליצירת אורגנואידים מוחיים של פרימטים משת?.......
אנו מתנצלים בפני כל החוקרים שלא ניתן היה לצטט את עבודתם בשל מגבלות מקום. אנו מודים לאולריך בלייר מהשירותים הטכניים ב-DPZ ולהרטמוט וולף מהסדנה ב-MPI-CBG על בניית תאי אלקטרודות צלחת פטרי; סטויאן פטקוב ורודיגר בהר על אספקת iPSCs לבני אדם (iLonza2.2), מקוק רזוס (iRh33.1) ומרמוסט (cj_160419_5); סברינה היידה עבור cryosectioning ו immunofluorescence צביעה; ונרינגה ליוטקאיט וסזאר מתאו בסטידס בטנקור על קריאה ביקורתית של כתב היד. העבודה במעבדה של W.B.H. נתמכה על ידי מענק ERA-NET NEUROON (MicroKin). העבודה במעבדה של מ.ה. נתמכה על ידי מענק התחלה של ERC (101039421).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
20 µL Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
2-Mercaptoethanol | Merck | 8.05740.0005 | |
35 mm cell culture dishes | Sarstedt | 83.3900 | |
60 mm cell culture dishes | CytoOne | CC7682-3359 | |
Activin A | Sigma-Aldrich | SRP3003 | |
AOC1 | Selleckchem | S7217 | |
Axio Observer.Z1 Inverted Fluorescence Microscope | Zeiss | replacable by comparable fluorescent microscopes | |
AZD0530 | Selleckchem | S1006 | |
B-27 Supplement with Vitamin A (retinoic acid, RA) (50x) | Gibco | 17504-044 | |
B-27 Supplement without Vitamin A (50x) | Gibco | 12587-010 | |
BTX ECM 830 Square Wave Electroporation System | BTX | 45-2052 | |
CGP77675 | Sigma-Aldrich | SML0314 | |
Chimpanzee induced pluripotent stem cell line Sandra A | doi: 10.7554/elife.18683 | ||
Common marmoset induced pluripotent stem cell line cj_160419_5 | doi: 10.3390/cells9112422 | ||
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-094 | pH 7.0−7.3; warm to room temperature before use |
Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
Forskolin | Selleckchem | 2449 | |
GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050-061 | glutamine substitute supplement |
Heparin (1 mg/mL stock) | Sigma-Aldrich | H3149 | |
Human induced pluripotent stem cell line iLonza2.2 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
Human Neurotrophin-3 (NT-3) | PeproTech | 450-03 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
IWR1 | Sigma-Aldrich | I0161 | |
Leica MS5 stereomicroscope (MDG 17 transmitted-light base) | Leica | 10473849 | replacable by comparable stereomicroscopes |
Matrigel | Corning | 354277/354234 | basement membrane matrix; alternatively, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) can be used |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Sigma-Aldrich | M7145 | |
N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | |
Paraformaldehyde | Merck | 818715 | handle with causion due to cancerogenecity |
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | PanBiotech | P06-07100 | |
Petri dish electrode chamber | self-produced (see Supplemental File 1) | also commertially available | |
Pre-Pulled Glass Pipettes | WPI | TIP10LT | borosilicate glass pipettes with long taper, 10 µm tip diameter |
Pro-Survival Compound | MerckMillipore | 529659 | |
Recombinant Human/Murine/RatBrain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | PeproTech | AF-450-02 | |
Rhesus macaque induced pluripotent stem cell line iRh33.1 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotech | 130-104-368 | |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | proteolytic and collagenolytic enzyme mixture |
TrypLE | Gibco | 12604-013 | recombinant trypsin substitute; warm to room temperature before use |
Ultra-Low Attachment 96-well plates | Costar | 7007 | |
Y27632 | Stemcell Technologies | 72305 |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved