Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אלקטרופורציה של אורגנואידים מוחיים של פרימטים מספקת גישה מדויקת ויעילה להחדרת שינויים גנטיים חולפים לסוגי אבות ונוירונים שונים במערכת מודל הקרובה להתפתחות ניאו-קורטקס פיזיולוגי של פרימטים (פתו). זה מאפשר את המחקר של תהליכים נוירו-התפתחותיים ואבולוציוניים והוא יכול להיות מיושם גם עבור מודלים המחלה.

Abstract

קליפת המוח היא מבנה המוח החיצוני ביותר והיא אחראית על עיבוד הקלט החושי והפלט המוטורי; הוא נתפס כמקום מושבן של יכולות קוגניטיביות מסדר גבוה יותר אצל יונקים, במיוחד פרימטים. חקר תפקודי גנים במוחות של פרימטים הוא מאתגר מסיבות טכניות ואתיות, אך הקמת טכנולוגיית אורגנואיד המוח אפשרה לחקור את התפתחות המוח במודלים מסורתיים של פרימטים (למשל, מקוק רזוס ומרמוסט מצוי), כמו גם במינים של פרימטים שלא היו נגישים בעבר בניסוי (למשל, קופי אדם גדולים), במערכת מוצדקת מבחינה אתית ופחות תובענית מבחינה טכנית. יתר על כן, אורגנואידים במוח האנושי מאפשרים חקירה מתקדמת של הפרעות נוירו-התפתחותיות ונוירולוגיות.

מאחר שאורגנואידים במוח משחזרים תהליכים רבים של התפתחות המוח, הם גם מהווים כלי רב-עוצמה לזיהוי הבדלים ולהשוואה תפקודית בין הגורמים הגנטיים העומדים בבסיס התפתחות המוח של מינים שונים בהקשר אבולוציוני. יתרון גדול של שימוש באורגנואידים הוא האפשרות להכניס שינויים גנטיים, המאפשרים בדיקה של תפקודי גנים. עם זאת, המבוא של שינויים כאלה הוא מייגע ויקר. מאמר זה מתאר גישה מהירה וחסכונית לשינוי גנטי של אוכלוסיות תאים בתוך מבנים דמויי חדרים של אורגנואידים מוחיים של פרימטים, תת-סוג של אורגנואידים במוח. שיטה זו משלבת פרוטוקול שונה לייצור אמין של אורגנואידים מוחיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) שמקורם במרמוסט ונפוצים שמקורם במרמוסט עם גישת מיקרו-הזרקה ואלקטרופורציה. זה מספק כלי יעיל לחקר תהליכים נוירו-התפתחותיים ואבולוציוניים שניתן ליישם גם עבור מודלים של מחלות.

Introduction

חקירת ההתפתחות והאבולוציה הפיזיולוגית (הפתולוגית) של קליפת המוח היא משימה אימתנית שמתעכבת על ידי היעדר מערכות מודל מתאימות. בעבר, מחקרים כאלה היו מוגבלים למודלים דו-ממדיים של תרביות תאים (כגון אב עצבי ראשוני או תרביות תאים עצביים) ולמודלים אבולוציוניים רחוקים של בעלי חיים (כגון מכרסמים)1,2. בעוד מודלים אלה שימושיים להתמודדות עם שאלות מסוימות, הם מוגבלים במידול המורכבות, הרכב סוג התא, הארכיטקטורה התאית ודפוסי ביטוי הגנים של הניאוקורטקס האנושי המתפתח במצבים בריאים וחולים. מגבלות אלה מובילות, למשל, ליכולת תרגום ירודה של מודלים עכבריים של מחלות אנושיות למצב האנושי, כפי שמתואר במקרים מסוימים של מיקרוצפליה (למשל, Zh....

Protocol

1. תרבית של פרימטים מושרים

הערה: בשל החוסן שלה, השיטה המוצגת כאן יכולה להיות מיושמת על כל קו iPSC פרימטים. במאמר זה אנו מתארים ייצור אורגנואידים מוחיים מקווי iPSC אנושיים (iLonza2.2)29, שימפנזים (Sandra A)30, מקוק רזוס (iRh33.1)29 ומרמוסט מצוי (cj_160419_5)31

Representative Results

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר יצירה יעילה של אורגנואידים מוחיים מקווי iPSC אנושיים, שימפנזים, רזוס מקוק ומרמוסט מצוי עם שינויי תזמון מינימליים הנדרשים בין מינים שונים (איור 1A). אורגנואידים אלה יכולים להתחשמל בטווח של 20 dps עד 50 dps, בהתאם לנגישות של מבנים דמויי חדרים ואת שפע של אוכ?.......

Discussion

ההליכים המתוארים כאן מייצגים פרוטוקול אחיד ליצירת אורגנואידים מוחיים ממיני פרימטים שונים עם גישת אלקטרופורציה ממוקדת. זה מאפשר ביטוי חוץ רחמי של GOI במערכת מודל המדמה התפתחות ניאו-קורטקס פיזיולוגית של פרימטים (כולל בני אדם) (פתו). פרוטוקול מאוחד זה ליצירת אורגנואידים מוחיים של פרימטים משת?.......

Acknowledgements

אנו מתנצלים בפני כל החוקרים שלא ניתן היה לצטט את עבודתם בשל מגבלות מקום. אנו מודים לאולריך בלייר מהשירותים הטכניים ב-DPZ ולהרטמוט וולף מהסדנה ב-MPI-CBG על בניית תאי אלקטרודות צלחת פטרי; סטויאן פטקוב ורודיגר בהר על אספקת iPSCs לבני אדם (iLonza2.2), מקוק רזוס (iRh33.1) ומרמוסט (cj_160419_5); סברינה היידה עבור cryosectioning ו immunofluorescence צביעה; ונרינגה ליוטקאיט וסזאר מתאו בסטידס בטנקור על קריאה ביקורתית של כתב היד. העבודה במעבדה של W.B.H. נתמכה על ידי מענק ERA-NET NEUROON (MicroKin). העבודה במעבדה של מ.ה. נתמכה על ידי מענק התחלה של ERC (101039421).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
20 µL MicroloaderEppendorf5242956003
2-MercaptoethanolMerck8.05740.0005
35 mm cell culture dishesSarstedt83.3900
60 mm cell culture dishesCytoOneCC7682-3359
Activin ASigma-AldrichSRP3003
AOC1SelleckchemS7217
Axio Observer.Z1 Inverted Fluorescence MicroscopeZeissreplacable by comparable fluorescent microscopes
AZD0530Selleckchem S1006
B-27 Supplement with Vitamin A (retinoic acid, RA) (50x)Gibco17504-044
B-27 Supplement without Vitamin A (50x)Gibco12587-010
BTX ECM 830 Square Wave Electroporation SystemBTX45-2052
CGP77675Sigma-AldrichSML0314
Chimpanzee induced pluripotent stem cell line Sandra Adoi: 10.7554/elife.18683 
Common marmoset induced pluripotent stem cell line cj_160419_5doi: 10.3390/cells9112422
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)Gibco11320-033
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)Gibco14190-094pH 7.0−7.3; warm to room temperature before use
Fast GreenSigma-AldrichF7252-5G
ForskolinSelleckchem2449
GlutaMAX Supplement (100x)Gibco35050-061glutamine substitute supplement
Heparin (1 mg/mL stock)Sigma-AldrichH3149
Human induced pluripotent stem cell line iLonza2.2doi: 10.3390/cells9061349
Human Neurotrophin-3 (NT-3)PeproTech450-03
InsulinSigma-Aldrich19278
IWR1Sigma-AldrichI0161
Leica MS5 stereomicroscope (MDG 17 transmitted-light base)Leica10473849replacable by comparable stereomicroscopes
MatrigelCorning354277/354234basement membrane matrix; alternatively, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) can be used
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)Sigma-AldrichM7145
N-2 Supplement (100x)Gibco17502-048
Neurobasal mediumGibco21103-049
ParafilmSigma-AldrichP7793
Paraformaldehyde Merck818715handle with causion due to cancerogenecity
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)PanBiotechP06-07100
Petri dish electrode chamberself-produced (see Supplemental File 1)also commertially available
Pre-Pulled Glass PipettesWPITIP10LTborosilicate glass pipettes with long taper, 10 µm tip diameter
Pro-Survival CompoundMerckMillipore529659
Recombinant Human/Murine/RatBrain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)PeproTechAF-450-02
Rhesus macaque induced pluripotent stem cell line iRh33.1doi: 10.3390/cells9061349
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyi Biotech130-104-368
StemPro Accutase Cell Dissociation ReagentGibcoA1110501proteolytic and collagenolytic enzyme mixture
TrypLEGibco12604-013recombinant trypsin substitute; warm to room temperature before use
Ultra-Low Attachment 96-well platesCostar7007
Y27632Stemcell Technologies72305

References

  1. Marchetto, M. C. N., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19 (R1), R71-R76 (2010).
  2. Zhao, X., Bhattacharyya, A. Huma....

Explore More Articles

JoVE193

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved