Micro-TC e Análise Morfométrica de Cérebros Neonatais de Camundongos

Summary

Este estudo descreve os passos para a obtenção de imagens de alta resolução de cérebros neonatais de camundongos combinando microtomografia computadorizada (micro-TC) e um agente de contraste em amostras ex vivo . Descrevemos análises morfométricas básicas para quantificar o tamanho e a forma do cérebro nessas imagens.

Abstract

As neuroimagens são uma ferramenta valiosa para o estudo da morfologia cerebral em experimentos com modelos animais. A ressonância magnética (RM) tornou-se o método padrão para tecidos moles, embora sua baixa resolução espacial represente alguns limites para pequenos animais. Descrevemos um protocolo para obtenção de informações tridimensionais (3D) de alta resolução em crânios e cérebros de neonatos de camundongos por meio de microtomografia computadorizada (micro-TC). O protocolo inclui as etapas necessárias para dissecar as amostras, corar e escanear o cérebro e obter medidas morfométricas de todo o órgão e regiões de interesse (ROIs). A análise de imagens inclui a segmentação de estruturas e a digitalização de coordenadas de pontos. Em suma, este trabalho mostra que a combinação de micro-TC e solução de Lugol como meio de contraste é uma alternativa adequada para a obtenção de imagens do cérebro perinatal de pequenos animais. Esse fluxo de trabalho de imagem tem aplicações em biologia do desenvolvimento, biomedicina e outras ciências interessadas em avaliar o efeito de diversos fatores genéticos e ambientais no desenvolvimento cerebral.

Introduction

A microtomografia computadorizada (micro-TC) é uma ferramenta valiosa para diferentes campos de pesquisa. Em biologia, é especialmente adequado para pesquisa óssea por causa da absorção de raios-X em tecidos mineralizados. Devido a essa característica, diversas questões relacionadas^{ao desenvolvimento} ósseo1, metabolismo^{2, evolução3,4}, entre outros tópicos, têm sido abordadas com o auxílio da micro-TC. Em 2008, de Crespigny et ^al.5 mostraram que imagens de micro-TC de cérebros adultos de camundongos e coelhos poderiam ....

Protocol

Todos os procedimentos experimentais seguiram as diretrizes do Canadian Council on Animal Care.

1. Coleta e preparo das amostras

1. Preparar 500 mL de paraformaldeído (PFA) a 4%.
   1. Sob um fluxo de extração em um gabinete, adicione 20 g de pó de PFA a 250 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) em um copo de vidro de 1 L. Coloque o copo com um ímã sobre uma placa de agitação magnética.
   2. Mexa enquanto aquece. Com um termômetro, verifiqu.......

Discussion

Neste trabalho, um protocolo conciso para varredura de tecidos cerebrais neonatais de camundongos usando micro-CT com um agente de contraste é apresentado. Além disso, inclui procedimentos simples para obter resultados quantitativos e qualitativos. Com base nesses métodos, outras análises alternativas ou complementares podem ser realizadas.

Como mostrado no protocolo, as imagens de micro-TC podem ser analisadas de diferentes maneiras. Em estudos anteriores, nosso grupo estimou a variação.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
µCT 35	Scanco Medical AG		Note that Scanco does not offer the  µCT 35 anymore. Their smallest scanner is now the  µCT 45
Avizo	Visualization Sciences Group, VSG
C57BL/6 Mice	Bioterio Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata
Conical tubes	Daigger	CH-CI4610-1856
Flux cabinet	Esco	AC2-458
Glass beaker	Glassco	GL-229.202.10
Glass bottle	Simax	CFB017
Glass funnel	HDA	VI1108
HCl	Carlo Erba	403872	Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
I2	Cicarelli	804211	When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
KI	Cicarelli	PA131542.1210	When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
Magnetic stirring	Arcano	4925
NaOH	Cicarelli	1580110	Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
Orbital shaker	Biomint	BM021
Paraformaldehyde	Biopack	2000959400	Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
Paton spatula	Glassco	GL-377.303.01
PBS	Biopack	2000988800
Plastic Pasteur pipette	Daigger	9153
R	R Project		The package geomorph for R was used in the protocol (https://cran.r-project.org/web/packages/geomorph/index.html)
Scissors	Belmed
Sodium azide	Biopack	2000163500
Thermometer	Daigger	7650