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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Este estudo descreve os passos para a obtenção de imagens de alta resolução de cérebros neonatais de camundongos combinando microtomografia computadorizada (micro-TC) e um agente de contraste em amostras ex vivo . Descrevemos análises morfométricas básicas para quantificar o tamanho e a forma do cérebro nessas imagens.

Abstract

As neuroimagens são uma ferramenta valiosa para o estudo da morfologia cerebral em experimentos com modelos animais. A ressonância magnética (RM) tornou-se o método padrão para tecidos moles, embora sua baixa resolução espacial represente alguns limites para pequenos animais. Descrevemos um protocolo para obtenção de informações tridimensionais (3D) de alta resolução em crânios e cérebros de neonatos de camundongos por meio de microtomografia computadorizada (micro-TC). O protocolo inclui as etapas necessárias para dissecar as amostras, corar e escanear o cérebro e obter medidas morfométricas de todo o órgão e regiões de interesse (ROIs). A análise de imagens inclui a segmentação de estruturas e a digitalização de coordenadas de pontos. Em suma, este trabalho mostra que a combinação de micro-TC e solução de Lugol como meio de contraste é uma alternativa adequada para a obtenção de imagens do cérebro perinatal de pequenos animais. Esse fluxo de trabalho de imagem tem aplicações em biologia do desenvolvimento, biomedicina e outras ciências interessadas em avaliar o efeito de diversos fatores genéticos e ambientais no desenvolvimento cerebral.

Introduction

A microtomografia computadorizada (micro-TC) é uma ferramenta valiosa para diferentes campos de pesquisa. Em biologia, é especialmente adequado para pesquisa óssea por causa da absorção de raios-X em tecidos mineralizados. Devido a essa característica, diversas questões relacionadasao desenvolvimento ósseo1, metabolismo2, evolução3,4, entre outros tópicos, têm sido abordadas com o auxílio da micro-TC. Em 2008, de Crespigny et al.5 mostraram que imagens de micro-TC de cérebros adultos de camundongos e coelhos poderiam ....

Protocol

Todos os procedimentos experimentais seguiram as diretrizes do Canadian Council on Animal Care.

1. Coleta e preparo das amostras

  1. Preparar 500 mL de paraformaldeído (PFA) a 4%.
    1. Sob um fluxo de extração em um gabinete, adicione 20 g de pó de PFA a 250 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) em um copo de vidro de 1 L. Coloque o copo com um ímã sobre uma placa de agitação magnética.
    2. Mexa enquanto aquece. Com um termômetro, verifiqu.......

Representative Results

Aqui, um protocolo básico para obtenção de imagens de alta resolução de cérebros neonatais de camundongos é apresentado. As cabeças foram escaneadas após imersão na solução de Lugol. Apesar de seu pequeno tamanho, as principais estruturas anatômicas cerebrais, como bulbos olfatórios, córtex, mesencéfalo, cerebelo e rombencéfalo, podem ser distinguidas (Figura 1).

Diferentes análises podem ser realizadas usando essas imagens como entradas. Um conj.......

Discussion

Neste trabalho, um protocolo conciso para varredura de tecidos cerebrais neonatais de camundongos usando micro-CT com um agente de contraste é apresentado. Além disso, inclui procedimentos simples para obter resultados quantitativos e qualitativos. Com base nesses métodos, outras análises alternativas ou complementares podem ser realizadas.

Como mostrado no protocolo, as imagens de micro-TC podem ser analisadas de diferentes maneiras. Em estudos anteriores, nosso grupo estimou a variação.......

Acknowledgements

Agradecemos a Wei Liu por sua assistência técnica. Este trabalho é financiado por ANPCyT PICT 2017-2497 e PICT 2018-4113.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
 µCT 35Scanco Medical AGNote that Scanco does not offer the  µCT 35 anymore. Their smallest scanner is now the  µCT 45 
AvizoVisualization Sciences Group, VSG
C57BL/6 MiceBioterio Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata
Conical tubesDaiggerCH-CI4610-1856
Flux cabinetEscoAC2-458 
Glass beaker GlasscoGL-229.202.10
Glass bottleSimaxCFB017
Glass funnelHDAVI1108
HClCarlo Erba403872Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
I2Cicarelli804211When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
KICicarelliPA131542.1210When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
Magnetic stirringArcano4925
NaOHCicarelli1580110Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
Orbital shakerBiomintBM021
Paraformaldehyde Biopack2000959400Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves)
Paton spatulaGlasscoGL-377.303.01
PBSBiopack2000988800
Plastic Pasteur pipetteDaigger9153
RR ProjectThe package geomorph for R was used in the protocol (https://cran.r-project.org/web/packages/geomorph/index.html)
Scissors Belmed
Sodium azideBiopack2000163500
ThermometerDaigger7650

References

  1. Altman, A. R., et al. Quantification of skeletal growth, modeling, and remodeling by in vivo micro-computed tomography. Bone. 81, 370-379 (2015).
  2. Wehrle, E., et al.

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