Imaging del calcio nel collicolo superiore del topo

Riepilogo

Questo protocollo descrive in dettaglio la procedura per l'imaging delle risposte del calcio nel collicolo superiore (SC) dei topi svegli, compreso l'imaging dell'attività di un singolo neurone con microscopia a due fotoni, lasciando intatta la corteccia nei topi wild-type, e l'imaging dell'intero SC con microscopia ad ampio campo nei topi mutanti a corteccia parziale.

Abstract

Il collicolo superiore (SC), una struttura del mesencefalo evolutivamente conservata in tutti i vertebrati, è il centro visivo più sofisticato prima dell'emergere della corteccia cerebrale. Riceve input diretti da ~30 tipi di cellule gangliari retiniche (RGC), ognuna delle quali codifica una specifica caratteristica visiva. Rimane incerto se il SC erediti semplicemente le caratteristiche retiniche o se si verifichi un'elaborazione aggiuntiva e potenzialmente de novo nel SC. Per rivelare la codifica neurale delle informazioni visive nel SC, forniamo qui un protocollo dettagliato per registrare otticamente le risposte visive con due metodi complementari nei topi svegli. Un metodo utilizza la microscopia a due fotoni per visualizzare l'attività del calcio a una risoluzione a singola cellula senza ablare la corteccia sovrapposta, mentre l'altro utilizza la microscopia ad ampio campo per visualizzare l'intero SC di un topo mutante la cui corteccia è in gran parte non sviluppata. Questo protocollo descrive in dettaglio questi due metodi, tra cui la preparazione dell'animale, l'iniezione virale, l'impianto della placca testa, l'impianto del tappo, l'acquisizione dei dati e l'analisi dei dati. I risultati rappresentativi mostrano che l'imaging del calcio a due fotoni rivela risposte neuronali evocate visivamente a una risoluzione a singola cellula e l'imaging del calcio ad ampio campo rivela l'attività neurale in tutto il SC. Combinando questi due metodi, si può rivelare la codifica neurale nel SC su scale diverse, e tale combinazione può essere applicata anche ad altre regioni del cervello.

Introduzione

Il collicolo superiore (SC) è un importante centro visivo in tutti i vertebrati. Nei mammiferi, riceve input diretti dalla retina e dalla corteccia visiva¹. Mentre la registrazione ottica è stata ampiamente applicata alla corteccia 2,3,4,5, la sua applicazione nel SC è ostacolata da scarsi accessi ottici 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite in conformità con le linee guida sul benessere degli animali e approvate dall'IACUC presso l'Istituto cinese per la ricerca sul cervello di Pechino.

NOTA: La tempistica per questo protocollo è la seguente: 1) fare la ventosa; 2) iniettare il virus; 3) impiantare la placca portatestina; 4) dopo 3 settimane, impiantare il tappo; 5) Dopo un recupero di ~ 3 giorni e l'assuefazione sul tapis roulant, eseguire l'imaging a due fotoni/ad ampio campo.

1. Preparazione di una ventosa (Figura 1A)

1. Depo....

Risultati

Le figure 1A,B mostrano come realizzare rispettivamente la ventosa e i tappi. La Figura 2 mostra come impiantare correttamente la spina. Dopo aver impiantato il tappo, l'SC posteriore-mediale viene esposto, come mostrato nella Figura 2D. La Figura 3 mostra le risposte del calcio dei neuroni SC da un esempio di topo wild-type ripreso utilizzando la microscopia a due fotoni. Il prisma tri.......

Discussione

Passaggi critici del protocollo
La fase più critica è la craniotomia nelle fasi 5.2 e 5.3. Innanzitutto, l'osso a 0,5 mm dietro la lambda è spesso e ha vasi sanguigni all'interno, che possono causare sanguinamento durante il processo di perforazione. Deve essere preparata un'adeguata schiuma di gel per fermare l'emorragia. In secondo luogo, c'è una buona probabilità di angioressi quando si rimuove l'osso appena sopra il seno trasverso. Per la risoluzione dei problemi, un approccio alternativo con.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
16x objective	Nikon
50-mm lens	Computar	M5018-MP2
5-mm coverslip	Warner instruments	CS-5R
bandpass filter	Chroma Technology	HQ575/250 m-2p
butyl cyanoacrylate	Vetbond, World Precision Instruments
camera for monitoring pupil	FLIR	BFS-U3-04S2M-CS
camera for widefield imaging	Basler	acA2000-165µm
corona treater	Electro-Technic Products	BD-20AC
dichroic	Chroma Technology	T600/200dcrb
galvanometers	Cambridge Technology
glass bead sterilizer	RWD	RS1502
microdrill	RWD	78001
micromanipulator	Sutter Instruments	QUAD
photomultiplier tube	Hamamatsu	R3896
rotory encoder	USdigital	MA3-A10-125-N
self-curing dental adhesive resin cement	SuperBond C&B, Sun Medical Co, Ltd. Moriyama, Japan
thermostatic heating pad	RWD	69020
Ti:Sapphire laser	Spectra-Physics	Mai Tai HP DeepSee
translucent silicone adhesive	Kwik-Sil, World Precision Instruments
treadmill	Xinglin Biology
Virus Strains
rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m	Vector Core at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Animals
C57BL/6J wild type	Laboratory Animal Resource Center at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Emx1-Cre	The Jackson Laboratory	5628
Pals1flox/wt	Christopher A. Walsh Lab
Software
ImageJ	NIH Image
Labview	National Instruments
MATLAB	Mathworks