Imagem de cálcio no colículo superior de camundongos

Summary

Este protocolo detalha o procedimento para obter imagens de respostas de cálcio no colículo superior (CS) de camundongos acordados, incluindo a obtenção de imagens da atividade de um único neurônio com microscopia de dois fótons, deixando o córtex intacto em camundongos selvagens, e a obtenção de imagens de todo o SC com microscopia de campo largo em camundongos mutantes do córtex parcial.

Abstract

O colículo superior (CS), uma estrutura mesencefálica conservada evolutivamente em todos os vertebrados, é o centro visual mais sofisticado antes do surgimento do córtex cerebral. Ele recebe entradas diretas de ~30 tipos de células ganglionares da retina (RGCs), com cada uma codificando uma característica visual específica. Permanece indefinido se o CT simplesmente herda características retinianas ou se ocorre processamento adicional e potencialmente de novo no CS. Para revelar a codificação neural da informação visual no CS, fornecemos aqui um protocolo detalhado para registrar opticamente as respostas visuais com dois métodos complementares em camundongos acordados. Um método usa microscopia de dois fótons para obter imagens da atividade do cálcio em resolução de célula única sem ablar o córtex sobreposto, enquanto o outro usa microscopia de campo largo para obter imagens de toda a CT de um camundongo mutante cujo córtex é em grande parte subdesenvolvido. Este protocolo detalha esses dois métodos, incluindo preparação animal, injeção viral, implante de placa cefálica, implante de plug, aquisição de dados e análise de dados. Os resultados representativos mostram que a imagem de cálcio de dois fótons revela respostas neuronais visualmente evocadas em resolução de célula única, e a imagem de cálcio de campo largo revela atividade neural em toda a CT. Combinando esses dois métodos, pode-se revelar a codificação neural no CT em diferentes escalas, e tal combinação também pode ser aplicada a outras regiões cerebrais.

Introduction

O colículo superior (CS) é um importante centro visual em todos os vertebrados. Em mamíferos, recebe entradas diretas da retina e do córtex visual¹. Embora o registro óptico tenha sido amplamente aplicado no córtex 2,3,4,5, sua aplicação no CT é dificultada por acessos ópticos precários 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 <....

Protocol

Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as diretrizes de bem-estar animal e aprovados pela IACUC no Instituto Chinês de Pesquisa do Cérebro, Pequim.

OBS: O cronograma para este protocolo é o seguinte: 1) fazer a ventosa; 2) injetar o vírus; 3) implantar a placa cefálica; 4) após 3 semanas, implantar o plug; 5) após uma recuperação de ~3 dias e habituação na esteira, realizar imagens de dois fótons/campo largo.

1. Preparo.......

Discussion

Etapas críticas do protocolo
A etapa mais crítica é a craniotomia nas etapas 5.2 e 5.3. Primeiro, o osso 0,5 mm posterior ao lambda é espesso e tem vasos sanguíneos dentro, o que pode causar sangramento durante o processo de perfuração. Espuma de gel adequada deve ser preparada para parar o sangramento. Em segundo lugar, há uma boa chance de angiorrhexis ao remover o osso logo acima do seio transverso. Para solução de problemas, uma abordagem alternativa é afinar o osso dentro do oval e rem.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16x objective	Nikon
50-mm lens	Computar	M5018-MP2
5-mm coverslip	Warner instruments	CS-5R
bandpass filter	Chroma Technology	HQ575/250 m-2p
butyl cyanoacrylate	Vetbond, World Precision Instruments
camera for monitoring pupil	FLIR	BFS-U3-04S2M-CS
camera for widefield imaging	Basler	acA2000-165µm
corona treater	Electro-Technic Products	BD-20AC
dichroic	Chroma Technology	T600/200dcrb
galvanometers	Cambridge Technology
glass bead sterilizer	RWD	RS1502
microdrill	RWD	78001
micromanipulator	Sutter Instruments	QUAD
photomultiplier tube	Hamamatsu	R3896
rotory encoder	USdigital	MA3-A10-125-N
self-curing dental adhesive resin cement	SuperBond C&B, Sun Medical Co, Ltd. Moriyama, Japan
thermostatic heating pad	RWD	69020
Ti:Sapphire laser	Spectra-Physics	Mai Tai HP DeepSee
translucent silicone adhesive	Kwik-Sil, World Precision Instruments
treadmill	Xinglin Biology
Virus Strains
rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m	Vector Core at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Animals
C57BL/6J wild type	Laboratory Animal Resource Center at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Emx1-Cre	The Jackson Laboratory	5628
Pals1flox/wt	Christopher A. Walsh Lab
Software
ImageJ	NIH Image
Labview	National Instruments
MATLAB	Mathworks