이 연구는 체코 과학 아카데미 RVO 68378050, MEYS CR LM2018126, OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001789(체코 표현유전체학 센터의 업그레이드: MEYS 및 ESIF의 번역 연구를 위한 개발), OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015861(MEYS 및 ESIF에 의한 CCP 인프라 업그레이드 II) 및 OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395(MEYS 및 ERDF에 의한 형질전환 모델의 고품질 및 용량). 또한, 이 연구는 체코 교육청소년체육부에서 제공하는 NGO "유전자 치료 협회(ASGENT)", 체코(https://asgent.org/) 및 체코 표현유전체학 센터로부터 자금을 지원LM2023036.

이 연구에 사용된 모든 동물과 실험은 윤리적 검토를 거쳤으며 유럽 지침 2010/63/EU에 따라 수행되었습니다. 이 연구는 체코 동물 복지 중앙위원회의 승인을 받았습니다. 마우스를 개별적으로 환기된 케이지에 수용하고 12시간의 명암 주기로 22± 2°C의 일정한 온도로 유지했습니다. 마우스에는 마우스 차우와 물이 임의로 제공되었습니다. 마우스는 케이지 당 3-6 마리의 동물 그룹으로 수용되?...

행동 테스트를 사용하여 Angelman Syndrome의 Murine 모델 검증

다른 쥐 균주에서 생성된 AS 모델은 일반적으로 동물의 감정 상태, 운동 기능 및 인지 능력에 대한 테스트를 통해 검증되어 인간 증상과의 비교를 용이하게 합니다31,32. AS 모델의 운동 결핍은 실험실 전체에서 가장 일관된 발견이며, 돌연변이의 변하지 않은 감정 상태와 둥지 짓기 어려움이 그 뒤를 잇습니다31,32,33...

Angelman 증후군 (AS)은 드문 신경 발달 질환입니다. AS의 가장 흔한 유전적 기원은 모계 유래 염색체의 15q11-q13 영역의 큰 결실이며, 이는 환자의 거의 74%에서 발견된다1. 이 영역의 결실은 E3 유비퀴틴 리가제를 암호화하는 AS의 주요 원인 유전자인 UBE3A의 손실을 유발합니다. 뉴런에서 UBE3A 유전자의 부계 대립 유전자는 각인으로 알려진 과정에서 침묵합니다. 결과적으로, 유전자의 부계 각인은 중추 신경계 (CNS)에서 모계 발현 만 허용합니다 2. 따라서 모계 유래 염색체에서 UBE3A 유전자가 결실되면 AS 증상이 발생합니다. 인간의 경우, AS는 생후 6개월경에 나타나며, 발달 지연은 모든 발달 단계에 걸쳐 지속되며, 영향을 받은 개인에게 심각한 쇠약 증상을 초래한다 3,4. 이 장애의 핵심 증상에는 갑작스러운 운동 실조 보행, 심각한 언어 장애 및 지적 장애를 포함한 미세 및 대근육 운동 능력의 결핍이 포함됩니다. AS 환자의 약 80%는 또한 수면 장애 및 간질을 앓고 있습니다. 현재까지 유일하게 이용 가능한 치료법은 간질 발작을 줄이고 수면의 질을 향상시키는 증상 약물입니다1. 따라서 정제된 표현형 분석과 함께 재현 가능한 행동 표현형을 가진 강력한 동물 모델의 개발은 장애의 병태생리학적 메커니즘을 밝히고 효과적인 약물 및 치료법을 발견하는 데 필수적입니다.
CNS에 영향을 미치는 인간 장애의 복잡성은 모델 유기체가 유사한 게놈, 생리학 및 행동을 소유할 것을 요구합니다. 마우스는 짧은 생식 주기, 작은 크기 및 DNA 변형의 상대적 용이성으로 인해 모델 유기체로 인기가 있습니다. 1984년, 폴 윌너(Paul Willner)는 모델의 값을 결정하는 데 사용되는 세 가지 기본 질병 모델 검증 기준, 구성, 얼굴 및 예측 타당도를 제안했다5. 간단히 말해서, 작제물 타당도는 장애 발생을 담당하는 생물학적 메카니즘을 반영하고, 얼굴 타당성은 그 증상을 요약하고, 예측 타당도는 치료 약물에 대한 모델 반응을 설명한다.
위의 원칙을 고수하기 위해 우리는 AS 모델 마우스를 만들기 위해 가장 일반적인 유전적 병인인 UBE3A 유전자를 포함한 모계 15q11.2-13q 유전자좌의 대규모 결실을 선택했습니다. 우리는 CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 C57BL/6N 배경의 마우스에서 유전자의 코딩 요소와 비코딩 요소를 모두 포함하는 전체 UBE3A 유전자에 걸쳐 있는 76,225bp 길이의 영역을 삭제했습니다6. 그런 다음 동물을 사육하여 UBE3A+/- 이형접합체 마우스를 얻었습니다. 모델의 얼굴 검증을 위해 UBE3A+/- 암컷과 야생형 수컷의 교배된 동물을 사용하여 UBE3A+/- 자손(C57BL/6NCrl-UBE3A<em1(IMPC)Ccpcz>/Ph로 명명되고 나중에 UBE3A mGenedel/+로 할당됨) 및 대조군 새끼를 얻었습니다. 우리는 그들의 미세하고 총체적인 운동 능력, 감정 및 영향을 테스트하여 핵심 AS 증상을 요약했습니다. 이전 논문에서는 동물의 인지 기능도 평가했는데, AS 환자도 지적 장애를 앓고 있기 때문이다6. 그러나 UBE3AmGenedel/+ 마우스에서 인지 장애는 발견되지 않았는데, 이는 아마도 실험 당시 동물의 나이가 어렸기 때문일 것입니다7. 나중에 18 주 된 나이 든 동물을 조사한 결과, 장소 선호 패러다임에서 반전 학습 동안 행동 유연성이 부족한 것으로 나타났습니다. 그러나 이 분석에 사용된 장비의 복잡성으로 인해 별도의 방법론 모듈이 필요하며 여기에는 포함되지 않습니다.
여기에 제시된 행동 테스트는 높은 예측 가치와 충분한 구성 타당도 8,9,10 덕분에 유전 연구에서 일반적인 표현형 도구에 속합니다. 우리는 이러한 테스트를 사용하여 재현 가능하고 연령에 구애받지 않는 방식으로 인간 질병의 핵심 증상을 요약하여 AS의 마우스 모델을 검증했습니다. 동물의 감정은 상승 플러스 미로 및 오픈 필드 테스트에서 평가되었습니다. 이 두 가지 테스트는 동물이 음식, 피난처 또는 짝짓기 기회를 찾기 위해 새로운 환경을 탐색하는 동시에 불안을 유발하는 구획을 피하는 접근 회피 갈등을 기반으로 합니다11. 또한, 개방 필드 테스트는 마우스의 운동 활동을 테스트하기 위해 사용된다8. 꼬리 서스펜션 테스트는 마우스 녹아웃 모델12에서 새로운 항우울제 또는 우울 유사 표현형을 선별하기 위해 우울증 연구에서 널리 사용됩니다. 이 테스트는 피할 수 없는 상황에서 시간이 지남에 따라 동물이 발전하는 절망을 평가합니다. 운동 학습과 상세한 보행 특성은 각각 rotarod와 DigiGait에서 결정되었습니다. 가속 막대에 대한 동물의 지구력은 균형 및 운동 조정 기술을 특징 짓는 반면, 마우스의 단계 패턴에 대한 상세한 분석은 많은 신경 생성 운동 장애13,14,15와 관련된 신경근 장애에 대한 민감한 평가입니다. 네슬렛 파쇄 테스트는 설치류의 충동적인 행동을 감지하기 위한 표준 방법론의 일부이며, 자연적인 설치류 형성 행동을 이용하기 때문에 동물의 웰빙을 나타냅니다16,17.
실험군의 규모는 3R 규칙 요구 사항을 충족하기 위한 타협과 군체 육종 성능의 효율적인 사용의 결과였습니다. 그러나 통계적 검정력을 얻기 위해 그룹은 충분한 양의 번식 쌍을 확립했기 때문에 10 명 이상의 개체를 가졌습니다. 불행하게도, 번식 성과가 항상 충분한 수의 동물을 낳는 것은 아닙니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cages, individually ventilated</td>
			<td>Techniplast</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigiGait</td>
			<td>Mouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level 
			Unit 110 
			Framingham, MA 01701, USA</td>
			<td>Equipment was tendered, no catalogue&#160; number was provided, nor could be find on company&#39;s web site</td>
			<td>Detailed analysis of mouse gait, hardware and software provided.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDA Nestlet squares</td>
			<td>Datesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, UK</td>
			<td>Material was bought from Velaz vendor via direct email request. Velaz do not provide any catalogue no.</td>
			<td>Cotton nestlets for nest building test. Nestlet discription: 2-3 g each, with diameter around 5 x 5 x 0.5cm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse chow</td>
			<td>Altramion</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotarod</td>
			<td>TSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4 
			12489 Berlin, Germany</td>
			<td>Equipment was tendered, no catalogue&#160; number was provided, nor could be find on company&#39;s web site</td>
			<td>Rotarod for 5 mice, hardware and software provided. Drum dimensions: Diameter: 30 mm, width per lane: 50 mm, falling distance 147 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tail Suspension Test</td>
			<td>Bioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles 
			FRANCE</td>
			<td>Reference: BIO-TST5</td>
			<td>Fully automated equipment for immobility time evaluation of 3 mice hanged by tail, hardware and software provided</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transpore medical tape</td>
			<td>Medical M, Ltd.</td>
			<td>P-AIRO1291</td>
			<td>The tape used to attach an animal to the hook by its tail.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viewer - Video Tracking System</td>
			<td>Biobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A 
			53111 Bonn, Germany</td>
			<td>Equipment with software were tendered, no catalogue&#160; number was provided, nor could be find on company&#39;s web site</td>
			<td>Software with custom made hardware: maze, IR base, IR sensitive cameras. Custom-made OF dimensions: 42 x 42 cm area, 49 cm high wall, central zone area: 39 cm2. A custom-made EPM was elevated 50 cm above the floor, with an open arm 79 cm long,&#160; 9 cm wide, and closed arm 77 cm long, 7.6 cm wide.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

behavioral characterization of an angelman syndrome mouse model

이 원고는 확립된 쥐 모델의 AS에서 Angelman 증후군(AS) 유사 표현형을 특성화하는 데 사용할 수 있는 일련의 행동 테스트를 설명합니다. 우리는 로타로드 학습 패러다임, 상세한 보행 분석 및 둥지 짓기 테스트를 사용하여 동물의 운동 장애를 감지하고 특성화합니다. 우리는 오픈 필드와 상승 플러스 미로 테스트에서 동물의 감정을 테스트하고 꼬리 서스펜션 테스트의 영향을 테스트합니다. AS 마우스를 오픈 필드 테스트에서 테스트할 때 운동 기능 장애가 미로에서 마우스 행동에 영향을 미치고 활동 점수를 변경하기 때문에 결과를 신중하게 해석해야 합니다.
제시된 행동 테스트의 재현성과 효과는 다양한 녹아웃 변형이 있는 여러 독립적인 Uba3a 마우스 라인에서 이미 검증되었으며, 이 테스트 세트는 AS 연구에서 우수한 검증 도구로 자리 잡았습니다. 관련 구조와 얼굴 타당성을 가진 모델은 질병의 병태생리학을 밝히고 인과적 치료법의 개발을 승인하기 위한 추가 조사가 필요합니다.

Angelman syndrome (AS) is a rare neurodevelopmental disease. The most common genetic origin of AS is a large deletion of the 15q11-q13 region of the maternally-derived chromosome, which is found in nearly 74% of patients1. Deletion of this region causes the loss of UBE3A, the main causative gene of AS that encodes an E3 ubiquitin ligase. The paternal allele of the UBE3A gene in neurons is silenced in a process known as imprinting. As a consequence, paternal imprinting of the gene allows only maternal expression in the central nervous system (CNS)2. Therefore, UBE3A gene deletion from the maternally-derived chromosome leads to the development of AS symptoms. In humans, AS manifests at around 6 months of age, with developmental retardation that persists throughout all developmental stages and results in severe debilitating symptoms in affected individuals3,4. The core symptoms of the disorder include the deficit of fine and gross motor skills, including jerky ataxic gait, serious speech impairment, and intellectual disability. Approximately 80% of AS patients also suffer from sleep disturbances and epilepsy. To date, the only available treatment are symptomatic drugs, which reduce epileptic seizures and improve sleep quality1. Therefore, the development of robust animal models with reproducible behavioral phenotypes alongside refined phenotyping analysis will be essential to elucidate the pathophysiological mechanisms of the disorder and discover effective medications and treatments.
The complexity of the human disorder affecting the CNS demands model organisms to possess a comparable genome, physiology, and behavior. Mice are popular as a model organism due to their short reproductive cycle, small size, and relative ease of DNA modification. In 1984, Paul Willner proposed three basic disease model validation criteria: the construct, face, and predictive validity, which are used to determine the model&#39;s value5. Simply, construct validity reflects the biological mechanisms responsible for the disorder development, face validity recapitulates its symptoms, and predictive validity describes the model response to therapeutic drugs.
To adhere to the above principles, we have chosen the most common genetic etiology, a large deletion of the maternal 15q11.2-13q locus including the UBE3A gene, to create AS model mice. We used the CRISPR/Cas9 technique to delete a 76,225 bp long region spanning the entire UBE3A gene, encompassing both the coding and non-coding elements of the gene, in mice from a C57BL/6N background6. We then bred the animals to obtain UBE3A+/&#8722; heterozygous mice. For face validation of the model, we used animals from crosses of UBE3A+/&#8722; females and wild-type males to gain UBE3A+/- progeny (strain named C57BL/6NCrl-UBE3A&#60;em1(IMPC)Ccpcz&#62;/Ph and later assigned as UBE3AmGenedel/+) and control littermates. We tested their fine and gross motor skills, emotionality, and affect to recapitulate core AS symptoms. In a previous article, we also evaluated the animals&#39; cognitive functions, as AS patients also suffer from intellectual disability6. However, we found no cognitive impairments in UBE3AmGenedel/+ mice, perhaps due to the young age of the animals at the time of testing7. Later examination of the older animals, around 18 weeks old, revealed a deficit in behavioral flexibility during reversal learning in the place preference paradigm. However, the complexity of the employed equipment for this analysis requires a separate methodological module and it is not included here.
The behavioral tests presented here belong to the common phenotyping tools in genetic research, thanks to their high predictive value and sufficient construct validity8,9,10. We used these tests to validate a mouse model of AS by recapitulating core symptoms of the human disease in a reproducible, age-independent manner. The emotionality of the animal was evaluated in the elevated plus maze and open field tests. Both of these tests are based on the approach-avoidance conflict, where animals explore a new environment in search of food, shelter, or mating opportunities while simultaneously avoiding anxiogenic compartments11. Additionally, the open field test is used to test a mouse&#39;s locomotor activity8. The tail suspension test is widely used in depression research to screen for new antidepressant drugs or depressive-like phenotypes in mouse knockout models12. This test evaluates the despair that animals develop over time in an inescapable situation. Motor learning and detailed gait characteristics were determined on the rotarod and in DigiGait, respectively. Animal endurance on the accelerating rod characterizes its balance and movement coordination skills, while detailed analysis of a mouse&#39;s step patterns is a sensitive evaluation of neuromuscular impairments connected to many neurogenerative movement disorders13,14,15. The nestlet shredding test is part of the standard methodology for detecting impulsive behavior in rodents, and since it utilizes natural rodent building behavior, it indicates the animal&#39;s well-being16,17.
The size of the experimental groups was a result of a compromise to meet the 3R rule demands and efficient usage of colony breeding performance. However, to obtain statistical power, the groups had no fewer than 10 individuals, due to the establishment of a sufficient amount of breeding pairs. Unfortunately, breeding performance did not always result in a sufficient number of animals.

저자 스포트라이트: Angelman Syndrome 쥐 모델을 검증하기 위한 고도로 재현 가능한 행동 테스트 배터리 

Angelman 증후군 마우스 모델의 행동 특성

Our goal is to elucidate the physiological roles of genes using mice as an experimental model. We also focus on developing mouse models of specific diseases that scientists can use to investigate disease causation and develop effective treatments. An example of such activity is the mouse model of Angelman syndrome.Arguably, the most promising new technology with potential is integrating artificial intelligence based on deep learning techniques in animal research. This approach can be used to monitor animal behavior in the home cage directly without need for the experimenter to disturb the animals. The biggest challenge in behavioral studies currently is reproducibility.Therefore, we introduce a battery of tests that validate the Angelman syndrome of model in a way that does not depend on the model's age or species. We use established behavioral tests to validate our AS model. However, with the novel approach for the model development closely resembling the human condition with a large deletion.Using CRISPR technology, we deleted the entire UBE3A gene from the mouse genome. In contrast to other models where the deletion is limited to 3KB. We're working on developing a genetic therapy that could restore a symptoms in a mouse model.

상승 플러스 미로 및 오픈 필드 테스트 EPM 및 OF 테스트는 설치류가 새로운 환경을 탐색하는 자연적 경향을 사용합니다18,19. 탐사는 설치류가 새로운 환경의 탐사와 가능한 위험 회피 중에서 선택하는 접근 회피 충돌에 의해 지배됩니다. 동물들은 피난처, 사회적 접촉 또는 먹이를 찾기 위해 알려지지 않은 장소를 탐험합니다. 그러나 새로...

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이 원고는 Angelman 증후군 마우스 모델을 검증하기 위해 재현 가능한 행동 테스트 세트를 제공합니다.

This manuscript describes a battery of behavioral tests available to characterize Angelman syndrome (AS)-like phenotypes in an established murine model of ...

우리의 목표는 마우스를 실험 모델로 사용하여 유전자의 생리적 역할을 밝히는 것입니다. 우리는 또한 과학자들이 질병의 원인을 조사하고 효과적인 치료법을 개발하는 데 사용할 수 있는 특정 질병의 마우스 모델을 개발하는 데 중점을 둡니다. 이러한 활동의 예는 Angelman 증후군의 마우스 모델입니다.틀림없이 잠재력을 가진 가장 유망한 신기술은 동물 연구에서 딥 러닝 기술을 기반으로 인공 지능을 통합하는 것입니다. 이 접근법은 실험자가 동물을 방해 할 필요없이 홈 케이지에서 동물의 행동을 직접 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 현재 행동 연구에서 가장 큰 과제는 재현성입니다.따라서 우리는 모델의 나이 또는 종에 의존하지 않는 방식으로 모델의 Angelman 증후군을 검증하는 일련의 테스트를 소개합니다. 우리는 AS 모델을 검증하기 위해 확립된 행동 테스트를 사용합니다. 그러나, 모델 개발을 위한 새로운 접근 방식은 큰 결실과 함께 인간의 상태와 매우 유사하다.CRISPR 기술을 사용하여 마우스 게놈에서 전체 UBE3A 유전자를 삭제했습니다. 삭제가 3KB로 제한되는 다른 모델과 달리. 우리는 마우스 모델에서 증상을 회복시킬 수 있는 유전자 치료법을 개발하기 위해 노력하고 있습니다.

Angelman 증후군 마우스 모델의 행동 특성

Abstract