Dit onderzoek werd gefinancierd door subsidienummer PID2019-105128RB-I00 aan RSA, JMB en AA, en PGC2018-095795-B-I00 aan PFS en RML, beide gefinancierd door MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 en subsidienummers B31_20R (RSA, JMA en AA) en E35_17R (PFS en RML) en gefinancierd door Gobierno de Aragón. Het werk van RSA werd ondersteund door een subsidie van de Asociación Española Contra el Cáncer (AECC) PRDAR21487SOLE. De auteurs willen graag het gebruik van Servicio General de Apoyo a la Investigación-SAI, Universidad de Zaragoza, erkennen.

OPMERKING: Alle cultuurmedia en buffersamenstellingen zijn gespecificeerd in tabel 1. Voorafgaand aan de cybridegeneratie moeten zowel mitochondriale als nucleaire DNA-profielen van de donor- en ontvangercellen worden getypeerd om de aanwezigheid van genetische verschillen in beide genomen tussen cellijnen te bevestigen. In deze studie werd gebruik gemaakt van een in de handel verkrijgbare L929-cellijn en de daarvan afgeleide cellijn, L929dt, die spontaan werd gegenereerd in ons laboratorium (zie<sup cla...

Transmitochondriale cybrid-generatie uit suspensie-groeiende kankercellen

Sinds Otto Warburg meldde dat kankercellen hun metabolisme verschuiven en "aerobe glycolyse" versterken3,4 terwijl ze mitochondriale ademhaling verminderen, is de interesse in de rol van mitochondriën in kankertransformatie en -progressie exponentieel gegroeid. In de afgelopen jaren zijn mutaties in het mtDNA en mitochondriale disfunctie gepostuleerd als kenmerken van veel kankertypen25. Tot op heden hebben talrijke studies de mtDNA-varia...

Het herprogrammeren van het energiemetabolisme is een kenmerk van kanker1 dat voor het eerst werd waargenomen door Otto Warburg in de jaren 19302. Onder aerobe omstandigheden zetten normale cellen glucose om in pyruvaat, dat vervolgens acetyl-coA genereert, de mitochondriale machinerie voedt en cellulaire ademhaling bevordert. Niettemin toonde Warburg aan dat, zelfs onder normoxische omstandigheden, de meeste kankercellen pyruvaat verkregen uit het glycolyseproces omzetten in lactaat, waardoor ze hun weg verleggen om energie te verkrijgen. Deze metabole aanpassing staat bekend als het "Warburg-effect" en stelt sommige kankercellen in staat om te voorzien in hun energetische behoeften voor snelle groei en deling, ondanks het feit dat ATP minder efficiënt wordt gegenereerd dan het aërobe proces 3,4,5. In de afgelopen decennia hebben talrijke werken de implicatie van herprogrammering van het metabolisme in de progressie van kanker ondersteund. Vandaar dat tumor energetica wordt beschouwd als een interessant doelwit tegen kanker1. Als een centrale hub in het energetisch metabolisme en in de toevoer van essentiële voorlopers, spelen mitochondriën een sleutelrol in deze celaanpassingen die we tot op heden slechts gedeeltelijk begrijpen.
In overeenstemming met het bovenstaande zijn mitochondriale DNA (mtDNA) mutaties voorgesteld als een van de mogelijke oorzaken van deze metabole herprogrammering, die zou kunnen leiden tot een verminderde elektronentransportketen (ETC) prestaties6 en zou verklaren waarom sommige kankercellen hun glycolytische metabolisme verbeteren om te overleven. Er is inderdaad gemeld dat mtDNA mutaties in kankercellen accumuleert, aanwezig in ten minste 50% van de tumoren7. Een recente studie uitgevoerd door Yuan et al. meldde bijvoorbeeld de aanwezigheid van hypergemuteerde en afgeknotte mtDNA-moleculen in nier-, colorectale en schildklierkankers8. Bovendien hebben veel werken aangetoond dat bepaalde mtDNA-mutaties geassocieerd zijn met een agressiever tumorfenotype en met een toename van het metastatische potentieel van kankercellen 9,10,11,12,13,14,15,16.
Ondanks de schijnbare relevantie van het mitochondriale genoom in de progressie van kanker, is de studie van deze mutaties en hun bijdrage aan de ziekte een uitdaging geweest vanwege beperkingen in de experimentele modellen en technologieën die momenteel beschikbaar zijn17. Er zijn dus nieuwe technieken nodig om de echte impact van mitochondriaal DNA in de ontwikkeling en progressie van kankerziekten te begrijpen. In dit werk introduceren we een protocol voor transmitochondriale cybridegeneratie uit suspensie-groeiende kankercellen, gebaseerd op de herbevolking van rhodamine 6G-voorbehandelde cellen met geïsoleerde mitochondriën, dat de belangrijkste uitdagingen van traditionele cybridisatiemethoden overwint18,19. Deze methodologie maakt het gebruik van elke kerndonor mogelijk, ongeacht de beschikbaarheid van hun overeenkomstige ρ0-cellijn en de overdracht van mitochondriën van cellen die, volgens de traditionele technieken, moeilijk te enucleeren zouden zijn (d.w.z. niet-aanhangende cellijnen).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3500XL Genetic Analyzer&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4406016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4427368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anode Buffer Container 3500 Series</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4393927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>131015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford assay</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>5000002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cathode Buffer Container 3500 Series</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4408256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>131026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneticin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10131027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer Teflon pestle</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>196102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L929 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniProtean Tetra4 Gel System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Custom products</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide Solution 30%</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>A3626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POP-7</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4393714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAmp DNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine-6G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R4127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum Fetal Bovine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SspI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin/penicillin</td>
			<td>PAN biotech</td>
			<td>P06-07100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>P14030b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transmitochondrial cybrid generation using cancer cell lines

In de afgelopen jaren is het aantal studies gewijd aan het vaststellen van het verband tussen mitochondriën en kanker aanzienlijk gestegen. Er zijn echter nog meer inspanningen nodig om het verband met veranderingen in mitochondriën en tumorigenese volledig te begrijpen, evenals om tumor-geassocieerde mitochondriale fenotypes te identificeren. Om bijvoorbeeld de bijdrage van mitochondriën in tumorigenese en metastaseprocessen te evalueren, is het essentieel om de invloed van mitochondriën van tumorcellen in verschillende nucleaire omgevingen te begrijpen. Voor dit doel bestaat een mogelijke benadering uit het overbrengen van mitochondriën naar een andere nucleaire achtergrond om de zogenaamde cybride cellen te verkrijgen. In de traditionele cybridisatietechnieken wordt een cellijn zonder mtDNA (ρ0, nucleaire donorcel) opnieuw bevolkt met mitochondriën die zijn afgeleid van enucleated cellen of bloedplaatjes. Het enucleatieproces vereist echter een goede celhechting aan de kweekplaat, een kenmerk dat in veel gevallen gedeeltelijk of volledig verloren gaat in invasieve cellen. Bovendien is een andere moeilijkheid die in de traditionele methoden wordt gevonden, het bereiken van volledige verwijdering van het endogene mtDNA uit de mitochondriale ontvangercellijn om zuivere nucleaire en mitochondriale DNA-achtergronden te verkrijgen, waarbij de aanwezigheid van twee verschillende mtDNA-soorten in het gegenereerde cybride wordt vermeden. In dit werk presenteren we een mitochondriaal uitwisselingsprotocol toegepast op suspensie-groeiende kankercellen op basis van de herbevolking van rhodamine 6G-voorbehandelde cellen met geïsoleerde mitochondriën. Deze methodologie stelt ons in staat om de beperkingen van de traditionele benaderingen te overwinnen en kan dus worden gebruikt als een hulpmiddel om het begrip van de mitochondriale rol in kankerprogressie en metastase uit te breiden.

Reprogramming energy metabolism is a hallmark of cancer1 that was observed for the first time by Otto Warburg in the 1930s2. Under aerobic conditions, normal cells convert glucose into pyruvate, that then generates acetyl-coA, fuelling the mitochondrial machinery and promoting cellular respiration. Nevertheless, Warburg demonstrated that, even under normoxic conditions, most cancer cells convert pyruvate obtained from the glycolysis process into lactate, shifting their way to obtain energy. This metabolic adjustment is known as the &#34;Warburg effect&#34; and enables some cancer cells to supply their energetic demands for rapid growth and division, despite generating ATP less efficiently than the aerobic process3,4,5. In recent decades, numerous works have supported the implication of metabolism reprogramming in cancer progression. Hence, tumor energetics is considered an interesting target against cancer1. As a central hub in energetic metabolism and in the supply of essential precursors, mitochondria play a key role in these cell adaptations that, to date, we only partially understand.
In line with the above, mitochondrial DNA (mtDNA) mutations have been proposed as one of the possible causes of this metabolic reprogramming, which could lead to an impaired electron transport chain (ETC) performance6 and would explain why some cancer cells enhance their glycolytic metabolism to survive. Indeed, it has been reported that mtDNA accumulates mutations within cancer cells, being present in at least 50% of tumors7. For example, a recent study carried out by Yuan et al. reported the presence of hypermutated and truncated mtDNA molecules in kidney, colorectal, and thyroid cancers8.&#160;Moreover, many works have demonstrated that certain mtDNA mutations are associated with a more aggressive tumor phenotype and with an increase in the metastatic potential of cancer cells9,10,11,12,13,14,15,16.
Despite the apparent relevance of the mitochondrial genome in cancer progression, the study of these mutations and their contribution to the disease have been challenging due to limitations in the experimental models and technologies currently available17. Thus, new techniques to understand the real impact of mitochondria DNA in cancer disease development and progression are needed. In this work, we introduce a protocol for transmitochondrial cybrid generation from suspension-growing cancer cells, based on the repopulation of rhodamine 6G-pretreated cells with isolated mitochondria, that overcomes the main challenges of traditional cybridization methods18,19. This methodology allows the use of any nuclei donor regardless of the availability of their corresponding &#961;0 cell line and the transfer of mitochondria from cells that, following the traditional techniques, would be difficult to enucleate (i.e., non-adherent cell lines).

Auteur in de schijnwerpers: Transmitochondriale cybrid-generatie met behulp van kankercellijnen  

Transmitochondriale Cybride generatie met behulp van kankercellijnen

This research aims to better understand the contribution of mitochondrion in cancer progression and metastasis. The transmitochondrial cybrid generation can help us to elucidate how and at what level mitochondrial genotypes are involved in the aggressiveness of a tumor cell. One of the technologies to obtain information on mitochondrial role in cancer is cybrid generation.We combine this tool with a variety of other methods that include donative electrophoresis, respiration analysis and other mitochondrial functional assays, flow cytometry, proteomics, et cetera. The plasticity of cancer cells together with the interaction networks between nuclear and mitochondrial genes, increases the complexity of our experiments and data interpretation. This is one of the reasons why is necessary to develop a new experimental approaches.One of the most exciting findings from our research has been the discovery of two mitochondrial DNA mutations associated with detachment of cells from the play dish resembling metastasis generation and making the cells completely dependent on aerobic glycolysis, and also making them more tumorigenic and metastatic in in vivo models. This mitochondria exchange protocol can be applied to suspension growing cancer cells. The chronology can overcome the limitations of traditional approaches where the nucleation process and the complete removal of mitochondrial DNA from mitochondrial recipient cell lines often become a real challenge.

Na het volgen van het hierboven gepresenteerde protocol moet een homoplasmatische cybride cellijn met een geconserveerde nucleaire achtergrond maar met een nieuw mitochondriale genotype worden verkregen, zoals weergegeven in de schema's in figuur 1 en figuur 2. De zuiverheid van het mitochondriale en nucleaire DNA in de cybriden kan worden bevestigd door RFLP, zoals weergegeven in figuur 3, en door nucleaire DNA-genotyperingsanalyse...

Watch this Scientific Journal Video about Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines at JoVE.com

Dit protocol beschrijft een techniek voor cybridegeneratie uit suspensie-groeiende kankercellen als een hulpmiddel om de rol van mitochondriën in het tumorogene proces te bestuderen.

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...

Dit onderzoek heeft tot doel de bijdrage van mitochondrion aan kankerprogressie en metastase beter te begrijpen. De transmitochondriale cybride generatie kan ons helpen om op te helderen hoe en op welk niveau mitochondriale genotypes betrokken zijn bij de agressiviteit van een tumorcel. Een van de technologieën om informatie te verkrijgen over de mitochondriale rol bij kanker is cybride generatie.We combineren deze tool met een verscheidenheid aan andere methoden, waaronder donatieve elektroforese, ademhalingsanalyse en andere mitochondriale functionele assays, flowcytometrie, proteomics, enzovoort. De plasticiteit van kankercellen samen met de interactienetwerken tussen nucleaire en mitochondriale genen, verhoogt de complexiteit van onze experimenten en gegevensinterpretatie. Dit is een van de redenen waarom het nodig is om een nieuwe experimentele aanpak te ontwikkelen.Een van de meest opwindende bevindingen uit ons onderzoek is de ontdekking van twee mitochondriale DNA-mutaties geassocieerd met het loslaten van cellen van de speelschaal die lijken op het genereren van metastase en de cellen volledig afhankelijk maken van aerobe glycolyse, en ze ook meer tumorogene en metastatische in in vivo modellen maken. Dit mitochondriale uitwisselingsprotocol kan worden toegepast op suspensie groeiende kankercellen. De chronologie kan de beperkingen van traditionele benaderingen overwinnen, waarbij het nucleatieproces en de volledige verwijdering van mitochondriaal DNA uit mitochondriale ontvangercellijnen vaak een echte uitdaging worden.

Transmitochondriale Cybride generatie met behulp van kankercellijnen

Abstract