Генерация трансмитохондриальных цибридов с использованием линий раковых клеток

Summary

В этом протоколе описывается метод генерации цибрид из раковых клеток, растущих в суспензии, в качестве инструмента для изучения роли митохондрий в онкогенном процессе.

Abstract

В последние годы значительно возросло количество исследований, посвященных выяснению связи между митохондриями и раком. Тем не менее, все еще необходимы дополнительные усилия, чтобы полностью понять связь, связанную с изменениями в митохондриях и онкогенезе, а также для выявления митохондриальных фенотипов, связанных с опухолью. Например, чтобы оценить вклад митохондрий в процессы онкогенеза и метастазирования, важно понять влияние митохондрий опухолевых клеток в различных ядерных средах. Для этой цели один из возможных подходов состоит в переносе митохондрий в другой ядерный фон для получения так называемых клеток кибридов. В традиционных методах цибридизации клеточная линия, лишенная мтДНК (ρ⁰, ядерная донорская клетка), заселяется митохондриями, полученными либо из энуклеированных клеток, либо из тромбоцитов. Однако процесс энуклеации требует хорошей клеточной адгезии к культуральной пластине, особенность, которая частично или полностью теряется во многих случаях в инвазивных клетках. Кроме того, еще одна трудность, встречающаяся в традиционных методах, заключается в достижении полного удаления эндогенной мтДНК из клеточной линии митохондрий-реципиентов для получения чистых ядерных и митохондриальных фонов ДНК, избегая присутствия двух разных видов мтДНК в сгенерированном цибриде. В этой работе мы представляем протокол митохондриального обмена, применяемый к раковым клеткам, выращивающим суспензию, на основе репопуляции клеток, предварительно обработанных родамином 6G, изолированными митохондриями. Эта методология позволяет преодолеть ограничения традиционных подходов и, таким образом, может быть использована в качестве инструмента для расширения понимания роли митохондрий в прогрессировании рака и метастазировании.

Introduction

Перепрограммирование энергетического метаболизма является отличительной чертой рака¹, который впервые наблюдался Отто Варбургом в 1930-х годах². В аэробных условиях нормальные клетки превращают глюкозу в пируват, который затем генерирует ацетил-КоА, подпитывая митохондриальный механизм и способствуя клеточному дыханию. Тем не менее, Варбург продемонстрировал, что даже в нормоксических условиях большинство раковых клеток превращают пируват, полученный в процессе гликолиза, в лактат, изменяя свой путь к получению энергии. Эта метаболическая корректировка известна как «эффект Варбурга» и позволяет некоторым раковым клеткам ....

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все питательные среды и буферные композиции указаны в таблице 1. Перед генерацией цибридов должны быть типированы как митохондриальные, так и ядерные профили ДНК из донорских и реципиентных клеток, чтобы подтвердить наличие генетических различий в обоих геномах м?.......

Discussion

С тех пор, как Отто Варбург сообщил, что раковые клетки изменяют свой метаболизм и потенцируют «аэробный гликолиз»^3,4 при одновременном снижении митохондриального дыхания^, интерес к роли митохондрий в трансформации и прогрессировании рака вырос в геомет.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3500XL Genetic Analyzer	ThermoFisher Scientific	4406016
6-well plate	Corning	08-772-1B
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit	ThermoFisher Scientific	4427368
Anode Buffer Container 3500 Series	Applied Biosystems	4393927
Boric acid	PanReac	131015
Bradford assay	Biorad	5000002
Cathode Buffer Container 3500 Series	Applied Biosystems	4408256
Cell culture flasks	TPP	90076
DMEM high glucose	Gibco	11965092
EDTA	PanReac	131026
Ethidium Bromide	Sigma-Aldrich	E8751
Geneticin	Gibco	10131027
Homogenizer Teflon pestle	Deltalab	196102
L929 cell line	ATCC	CCL-1
MiniProtean Tetra4 Gel System	BioRad	1658004
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
PCR primers	Sigma-Aldrich	Custom products
Polyacrylamide Solution 30%	PanReac	A3626
Polyethylene glycol	Sigma-Aldrich	P7181
POP-7	Applied Biosystems	4393714
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280
QIAmp DNA Mini Kit	Qiagen	51306
Rhodamine-6G	Sigma-Aldrich	R4127
Serum Fetal Bovine	Sigma-Aldrich	F7524
SspI	New England Biolabs	R3132
Streptomycin/penicillin	PAN biotech	P06-07100
Sucrose	Sigma-Aldrich	S3089
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Tris	PanReac	P14030b
Uridine	Sigma-Aldrich	U3750