De auteurs willen Mant Acon bedanken voor de planten die in deze studie zijn gebruikt. De financiering werd verstrekt door het CRIS-project 8062-22410-007-000-D van het Amerikaanse ministerie van Landbouw (USDA) en USDA NIFA-subsidie 2020-70029-33176.

1. Productie van citrusplanten voor injectie van experimentele verbindingen
<ol><li>Vermeerder kleine citrusbomen in potten uit bewortelde vegetatieve stekken of zaden. Kweek de citruslijnen in pot onder een licht/donker daglengte van 16 uur/8 uur en bij 28 °C.</li>
	<li>Selecteer citrusplanten van de juiste grootte voor het experiment. De beschreven toepassingen vereisten dat de planten tussen de 12 cm en 100 cm hoog moesten zijn met stamdiameters van 4-14 mm. Als er nieuwe spoelgroei nodig is, snoei de planten dan terug voorafgaand aan het experiment.</li>
</ol>2. Driedimensionaal printen van het DPI-apparaat en matrijscomponenten
<ol><li>Breng een dunne laag lijm op basis van polyvinylacetaat aan op het printbed.</li>
	<li>Plaats nylon filament in de 3D-printer en bereid de printer voor volgens de instructies van de fabrikant. Importeer de gewenste . STL-bestand (aanvullend dossier 1, aanvullend dossier 2, aanvullend dossier 3, aanvullend dossier 4, aanvullend dossier 5, aanvullend dossier 6, aanvullend dossier 7, aanvullend dossier 8, aanvullend dossier 9, aanvullend dossier 10, aanvullend dossier 11, aanvullend dossier 11, aanvullend dossier 12, aanvullend dossier 13 en aanvullend bestand 14), instellen en afdrukken.</li>
	<li>Verwijder het stuk van het printbed. Spoel de lijm op basis van polyvinylacetaat van de basis van het geprinte onderdeel met water en verwijder eventuele ondersteuningsstructuren.</li>
	<li>Spuit de DPI-component in met twee lagen heldere glansspuitverf.</li>
</ol>3. Fabricage van de plastisol ring mal
<ol><li>Monteer een malvorm die groot genoeg is om de patroonstukken vast te houden door een rechthoekige behuizing te bouwen met behulp van in elkaar klikbare plastic blokken op een basis (aanvullende figuur S1A).</li>
	<li>Meng het RTV-siliconenmonomeer en de katalysator samen in een verhouding van 10:1 en roer zonder bubbels te introduceren gedurende 1 minuut. Kleur door toevoeging van voedselkleurstof (3 druppels / 25 ml siliconenmengsel) en handzeep (1 ml zeep / 25 ml siliconenmengsel) (aanvullende figuur S1B).</li>
	<li>Giet een dunne laag siliconen in de vorm die voldoende is om de bodem volledig te bedekken. Stamp om het oppervlak plat te maken en wacht 24 uur tot de siliconen zijn uitgehard (aanvullende figuur S1C).</li>
	<li>Giet een tweede laag siliconen, zoals hierboven beschreven, die diep genoeg is om de middelste kernafdruk op het patroon te bedekken (zichtbaar aan de bovenkant van het patroon in aanvullende figuur S1D). Steek het patroon in de vloeibare siliconen met de middelste kernafdruk naar beneden gericht. Zorg ervoor dat er geen bubbels worden opgesloten en dat de patronen goed gescheiden zijn en elkaar niet raken (aanvullende figuur S1E).</li>
	<li>Bevestig de patronen met een zwaar voorwerp en/of tape om te voorkomen dat ze uit de siliconen zweven terwijl deze uitzet. Wacht 24 uur totdat de nieuw gegoten laag is uitgehard (aanvullende figuur S1F).</li>
	<li>Giet extra lagen siliconen totdat het niveau gelijk is met de bovenkant van het patroon. Wacht 24 uur om uit te harden (aanvullende figuur S1G).</li>
	<li>Demonteer de in elkaar klikbare plastic blokken om de mal los te maken. Verwijder de patronen (aanvullende figuur S1H). Inspecteer de mal op scheuren of misvormingen (aanvullende figuur S1I).</li>
</ol>4. Gieten van de plastisolringen
<ol><li>Bedek de binnenkant van de mal, alle kerncomponenten en de O-ringen met bakolie (aanvullende figuur S2A, B). Plaats een O-ring rond de inkeping in het midden van de kern van de middelste paal en plaats de kern in het middelste gat van de plastisolringmal (aanvullende figuur S2C).</li>
	<li>Steek de kern van het afgiftekanaal in het gat aan de zijkant van de plastisolringvorm. Oriënteer de V-vormige punt aan het einde van de kern van het leveringskanaal om uit te lijnen met de O-ring op de kern van de middelste paal (aanvullende figuur S2D,E).</li>
	<li>Verwarm plastisol in de magnetron gedurende korte uitbarstingen van 10 s (aanvullende figuur S2F, G). Roer plastisol voorzichtig om bubbels te voorkomen (aanvullende figuur S2H). Herhaal het verwarmen en roeren totdat de oplossing een temperatuur bereikt tussen 160 °C en 170 °C (aanvullende figuur S2I). LET OP: Oververhitting van het plastisol kan leiden tot het vrijkomen van giftige dampen. Voer de procedure uit in een goed geventileerde ruimte of zuurkast. Verwarm de plastisol niet boven 170 °C.</li>
	<li>Giet de gesmolten plastisol in de plastisolringvorm aan de buitenrand van de mal zonder bubbels te introduceren (aanvullende figuur S2J). Wacht 1 uur tot de plastisolringen zijn afgekoeld (aanvullende figuur S2K). Verwijder de ringen uit de vorm. Zorg voor een goede pasvorm met het DPI-apparaat voor gebruik in experimentele assays (aanvullende figuur S2L).</li>
</ol>5. Bevestiging van het DPI-apparaat aan de installatie
<ol><li>Zoek een gladde, gezonde plek op de kofferbak voor de bevestiging van het apparaat. Vermijd hobbels of knopen, omdat deze kunnen bijdragen aan lekkage van het apparaat.</li>
	<li>Gebruik een boor met een diameter van 2 mm om een gat horizontaal door het midden van de steel te boren in een hoek van 90° met het stamoppervlak (aanvullende figuur S3A). Laat de boor meerdere keren door het gat lopen om het schoon te maken en glad te maken om een onbelemmerd gat te creëren (aanvullende figuur S3B).</li>
	<li>Maak een verticaal segment in de plastisolring aan de andere kant van het samengestelde afgiftekanaal (aanvullende figuur S3C). Plaats de ring om de plant en lijn het afgiftekanaal met het eerder geboorde gat (aanvullende figuur S3D). OPMERKING: De ring moet goed om de kofferbak passen om lekkages te voorkomen; Kernassemblages met verschillende diameters kunnen worden gebruikt om plastisolringen te maken voor plantenstengels van verschillende grootte.</li>
	<li>Voeg het DPI-apparaat toe aan de plastisolring en zorg ervoor dat ze goed op elkaar aansluiten. Lijn de tuit van het DPI-apparaat uit met het afgiftekanaal van de plastisolring en het geboorde gat (aanvullende figuur S3E). OPMERKING: Het gebruik van een boor om het gat en de tuit van het DPI-apparaat uit te lijnen kan nuttig zijn.</li>
	<li>Wikkel stevig met siliconentape om het apparaat op zijn plaats te houden (aanvullende figuur S3F). Inspecteer het volledig geassembleerde en bevestigde apparaat om de juiste uitlijning en oriëntatie op de installatie te garanderen.</li>
</ol>6. Het toepassen van de samengestelde rente met behulp van het DPI-apparaat
<ol><li>Gebruik een spuit of pipet om het DPI-apparaat te vullen met de oplossing van belang (aanvullende figuur S3G). Gebruik een spuit om de siliconentape en plastisolring aan de andere kant van het DPI-apparaat te penetreren om lucht uit het binnenkanaal te trekken en de introductie van luchtbellen in de plantenvasculatuur te voorkomen (aanvullende figuur S3H). Vervang alle geëxtraheerde verbindingen terug in het DPI-apparaat.</li>
	<li>Voeg een extra klein stukje siliconentape toe aan het gat dat door de spuit is gemaakt om het gebied te versterken en scheuren te voorkomen. Inspecteer het apparaat op zichtbare lekkages op het bevestigingspunt en inspecteer het apparaatreservoir op een stabiel vloeistofniveau. OPMERKING: Water kan in eerste instantie worden gebruikt om te testen op lekken om verspilling van de testoplossing te voorkomen.</li>
	<li>Bedek het open uiteinde van het DPI-apparaat met wasafdichtingsfilm en trek naar beneden om een afdichting te vormen en de verdamping van de experimentele verbinding te verminderen. Prik een enkel gat in de wasfilm met een spuitpunt om de ontwikkeling van een vacuüm te voorkomen en vul het apparaat vervolgens opnieuw (aanvullende figuur S3I).</li>
	<li>Controleer het apparaat dagelijks om ervoor te zorgen dat de componenten goed worden uitgelijnd (aanvullende figuur S3J) en vul de vloeistof af met een spuit om te voorkomen dat het reservoir droog wordt. Herhaal dit proces totdat de gewenste hoeveelheid experimentele oplossing is geïntroduceerd. OPMERKING: Verbindingen kunnen met succes worden geïntroduceerd vanaf een bepaald apparaat gedurende maximaal 1 maand. De opnameduur van de oplossing die dit tijdsbestek overschrijdt, moet empirisch worden getest vóór de experimentele opstelling.</li>
</ol>7. CFDA gebruiken om vasculaire bewegingen met citrusplanten te observeren
<ol><li>Bevestig het DPI-apparaat aan 25 cm hoge citroenplanten (Citrus medica L.), breng een enkele 2,0 ml behandeling van 20% DMSO in H2O-controle of CFDA aan op het DPI-apparaat en laat het gedurende 24 uur opnemen. Om dit protocol te volgen, bereidt u de werkende CFDA-oplossing voor door 1,6 ml H 2 O toe te voegen aan 400 μL CFDA-voorraadoplossing (de stamoplossing bevat 10 mM CFDA opgelost in 100% dimethylsulfoxide [DMSO]) om een uiteindelijke CFDA-concentratie van2mM en 20% DMSO te genereren.</li>
	<li>Maak doorsneden van verschillende weefsels van de plant en gebruik een stereoscoop of samengestelde microscoop met een fluorescerend filter dat de golflengte van 498 nm bevat om de CFDA in de plantenweefsels te visualiseren. Vergelijk de beelden met de 20% DMSO in H2O-controles om rekening te houden met autofluorescentie in het weefsel.</li>
</ol>8. Meten van veranderingen in de CLas-titer in bladmonsters na behandeling met streptomycine
<ol><li>Gebruik met behulp van 0,75 m hoge in de kas gekweekte CLas-geïnfecteerde Valencia (Citrus sinensis (L .) Osbeck "Valencia") planten, verzamel de bladsteel en middenrib van twee HLB-symptomatische bladeren van elke plant, hak ze in kleine secties, pool elk weefseltype en bewaar ze afzonderlijk in slagvaste monsterbuizen van 2 ml met een stalen bal met een diameter van 6,35 mm.</li>
	<li>Maal het monster met behulp van een homogenisator die is geprogrammeerd voor twee cycli van 15 s bij 3,4 m/s. Extraheer het totale nucleïnezuur zoals eerder beschreven19.</li>
	<li>Voer qPCR uit op de met CLas geïnfecteerde bladmonsters met behulp van de qPCR-mix zoals gedefinieerd in tabel 1 en de reactieomstandigheden gedefinieerd in tabel 2. Gebruik planten met robuuste CLas-infecties (robuuste infectie wordt over het algemeen gedefinieerd als op qPCR gebaseerde Ct-waarden < 30 voor de CLas 16S LasLong (LL) primerset) voor verdere analyse. OPMERKING: De bacteriële titer wordt geschat met behulp van CLas 16S Las Long (LL) en citrus dehydrine DNA-primers om de relatieve genoomequivalenten te schatten, zoals eerder beschreven20.</li>
	<li>Rust de citrusplanten die voldoen aan de hierboven beschreven minimale infectietiter uit met DPI-apparaten en onderwerp ze aan een eenmalige behandeling van 2,0 ml H2 O-oplossing of streptomycine-oplossing in de gewenste concentratie. Gebruik voor het volgen van deze studie een enkele behandeling van 2,0 ml van 9,5 mg / ml (19 mg in totaal) streptomycine opgelost in H2O.</li>
	<li>Verzamel bladmonsters 7 dagen, 14 dagen en 28 dagen na de behandeling. Test de bemonsterde bladeren op de CLas-titer met behulp van hetzelfde protocol als hierboven beschreven.</li>
	<li>Verkrijg 60 dagen na de behandeling foto's van de planten die zijn behandeld met H2O of streptomycine. Gebruik visuele observaties van de CLas-infectie om de ernst van de infectie te scoren. Zoek naar <50% van de bladeren die interveneuze chlorose en aderkurken vertonen, samen met bladspoelgroei als tekenen van milde infectie en meer dan 50% van de bladeren met interveneuze chlorose en aderkurken, evenals bladabscissie en groeiachterstand van de plant als tekenen van ernstigere infecties.</li>
</ol>9. Meting van de mortaliteit van D. citri na behandeling met imidacloprid
<ol><li>Snoei 0,5 m hoge citroenplanten (Citrus medica L.) tot een hoogte van 12 cm om de groei van nieuwe spoeling te stimuleren. OPMERKING: De snelheid van de spoelgroei kan afhankelijk zijn van de gezondheid van de plant en de tijd van het jaar; Houd hier dus rekening mee tijdens het experimenteel ontwerpen.</li>
	<li>Nadat >6 spoeling, 1-2 cm lang, zich hebben ontwikkeld, introduceren de planten in kooien met volwassen D. citri. Laat de planten 24 uur in de kooien staan om de afzetting van eieren mogelijk te maken.</li>
	<li>Voer representatieve eiertellingen uit op drie spoelscheuten 1-2 dagen na het leggen en breng vervolgens de DPI-apparaten aan. Vul deze apparaten met 2,0 ml van een watercontrole of de gewenste concentratie imidacloprid (21,8% actief ingrediënt). Gebruik voor het volgen van dit protocol 528 μL/L, 52,8 μL/L en 5,28 μL/L imidacloprid. OPMERKING: Eitellingen zijn een destructieve maatstaf, dus de tellingen in dit stadium worden gebruikt om het aantal eieren op de niet-getelde spoeling van dezelfde plant te schatten en helpen een basislijn te bieden voor de daaropvolgende nimfopkomsttellingen die aan het einde van het experiment worden uitgevoerd.</li>
	<li>Verzamel de D. citri-opkomstsnelheid op ten minste drie van de resterende vlakke scheuten . Verkrijg representatieve plantenfoto's 7 dagen na samengestelde introductie.</li>
</ol>

Toediening van moleculen in planten met behulp van een direct infusieapparaat

<ol>
	<li>Hu, J., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+spatiotemporal+dynamics+of+oxytetracycline+and+its+control+effect+against+citrus+huanglongbing+via+trunk+injection.">Evaluation of the spatiotemporal dynamics of oxytetracycline and its control effect against citrus huanglongbing via trunk injection.</a> Phytopathology. 106 (12), 1495-1503 (2016).</li><li>Bendix, C., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enemy+within:+Phloem-limited+pathogens.">The enemy within: Phloem-limited pathogens.</a> Molecular Plant Pathology. 19 (1), 238-254 (2018).</li><li>Keshavareddy, G., Kumar, A. R. V., Ramu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+plant+transformation-+A+review.">Methods of plant transformation- A review.</a> International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 7 (7), 2656-2668 (2018).</li><li>Qaim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+new+plant+breeding+technologies+for+food+security+and+sustainable+agricultural+development.">Role of new plant breeding technologies for food security and sustainable agricultural development.</a> Applied Economics Perspectives and Policy. 42 (2), 129-150 (2020).</li><li>Siegrist, M., Hartmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consumer+acceptance+of+novel+food+technologies.">Consumer acceptance of novel food technologies.</a> Nature Food. 1 (6), 343-350 (2020).</li><li>Larson, D. W., Doubt, J., Matthes-Sears, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radially+sectored+hydraulic+pathways+in+the+xylem+of+Thuja+occidentalis+as+revealed+by+the+use+of+dyes.">Radially sectored hydraulic pathways in the xylem of Thuja occidentalis as revealed by the use of dyes.</a> International Journal of Plant Sciences. 155 (5), 569-582 (1994).</li><li>Mehdi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symplasmic+phloem+unloading+and+radial+post-phloem+transport+via+vascular+rays+in+tuberous+roots+of+Manihot+esculenta.">Symplasmic phloem unloading and radial post-phloem transport via vascular rays in tuberous roots of Manihot esculenta.</a> Journal of Experimental Botany. 70 (20), 5559-5573 (2019).</li><li>Miller, G. S., Parente, R. M., Santra, S., Gesquiere, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+of+fluorescent+antibiotic+conjugate+in+planta+utilizing+fluorescence+lifetime+imaging.">Tracking of fluorescent antibiotic conjugate in planta utilizing fluorescence lifetime imaging.</a> Planta. 253 (2), (2021).</li><li>Treydte, K., Lehmann, M. M., Wyczesany, T., Pfautsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+and+axial+water+movement+in+adult+trees+recorded+by+stable+isotope+tracing.">Radial and axial water movement in adult trees recorded by stable isotope tracing.</a> Tree Physiology. 41 (12), 2248-2261 (2021).</li><li>Nie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liping+Hu,+Haiyan+Zhang,+Jixiang+Zhang,+Zhenxian+Zhang,+Lingyun+Zhang,+The+predominance+of+the+apoplasmic+phloem-unloading+pathway+is+interrupted+by+a+symplasmic+pathway+during+Chinese+jujube+fruit+development.">Liping Hu, Haiyan Zhang, Jixiang Zhang, Zhenxian Zhang, Lingyun Zhang, The predominance of the apoplasmic phloem-unloading pathway is interrupted by a symplasmic pathway during Chinese jujube fruit development.</a> Plant and Cell Physiology. 51 (6), 1007-1018 (2010).</li><li>Jiang, M., Deng, Z., White, R. G., Jin, T., Liang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shootward+movement+of+CFDA+tracer+loaded+in+the+bottom+sink+tissues+of+Arabidopsis.">Shootward movement of CFDA tracer loaded in the bottom sink tissues of Arabidopsis.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59606 (2019).</li><li>Liu, H., Si, C., Shi, C., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zhe+Sun,+Yanxi+Shi,+from+apoplasmic+to+symplasmic+phloem+unloading+during+storage+roots+formation+and+bulking+of+sweet+potato.">Zhe Sun, Yanxi Shi, from apoplasmic to symplasmic phloem unloading during storage roots formation and bulking of sweet potato.</a> Crop Science. 59 (2), 675-683 (2019).</li><li>Erdos, T., Ullmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+streptomycin+on+the+incorporation+of+amino-acids+labeled+with+carbon-14+into+ribonucleic+acid+and+protein+in+a+cell-free+system+of+a+Mycobacterium.">Effect of streptomycin on the incorporation of amino-acids labeled with carbon-14 into ribonucleic acid and protein in a cell-free system of a Mycobacterium.</a> Nature. 183 (4661), 618-619 (1959).</li><li>Bov&#233;, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huanglongbing:+A+destructive,+newly-emerging,+century-old+disease+of+citrus.">Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus.</a> Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).</li><li>Motaung, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloronicotinyl+insecticide+imidacloprid:+Agricultural+relevance,+pitfalls+and+emerging+opportunities.">Chloronicotinyl insecticide imidacloprid: Agricultural relevance, pitfalls and emerging opportunities.</a> Crop Protection. 131, 105097 (2020).</li><li>Berger, C., Laurent, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trunk+injection+of+plant+protection+products+to+protect+trees+from+pests+and+diseases.">Trunk injection of plant protection products to protect trees from pests and diseases.</a> Crop Protection. 124, 104831 (2019).</li><li>Archer, L., Crane, J. H., Albrecht, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trunk+injection+as+a+tool+to+deliver+plant+protection+materials-An+overview+of+basic+principles+and+practical+considerations.">Trunk injection as a tool to deliver plant protection materials-An overview of basic principles and practical considerations.</a> Horticulturae. 6 (6), 552 (2022).</li><li>Wise, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trunk+injection:+A+discriminating+delivering+system+for+horticulture+crop+IPM.">Trunk injection: A discriminating delivering system for horticulture crop IPM.</a> Entomology, Ornithology &amp; Herpetology: Current Research. 03 (2), (2014).</li><li>Ammar, E. D., George, J., Sturgeon, K., Stelinski, L. L., Shatters, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asian+citrus+psyllid+adults+inoculate+Huanglongbing+bacterium+more+efficiently+than+nymphs+when+this+bacterium+is+acquired+by+early+instar+nymphs.">Asian citrus psyllid adults inoculate Huanglongbing bacterium more efficiently than nymphs when this bacterium is acquired by early instar nymphs.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18244 (2020).</li><li>Stover, E., Mccollum, G., Ramos, J., Shatters, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth,+health+and+Liberibacter+asiaticus+titer+in+diverse+citrus+scions+on+mandarin+versus+trifoliate+hybrid+rootstocks+in+a+field+planting+with+severe+Huanglongbing.">Growth, health and Liberibacter asiaticus titer in diverse citrus scions on mandarin versus trifoliate hybrid rootstocks in a field planting with severe Huanglongbing.</a> Proceedings of the Florida State Horticultural Society. 127, 53-59 (2014).</li><li>Akaike, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+look+at+the+statistical+model+identification.">A new look at the statistical model identification.</a> IEEE Transactions on Automatic Control. 19 (6), 716-723 (1974).</li><li>Dalakouras, A., Jarausch, W., Buchholz, G., Bassler, A., Braun, M., Manthey, T., Krczal, G., Wassenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+hairpin+RNAs+and+small+RNAs+into+woods+and+herbaceous+plants+by+trunk+injection+and+petiole+absorption.">Delivery of hairpin RNAs and small RNAs into woods and herbaceous plants by trunk injection and petiole absorption.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 1253 (2018).</li><li>Ammar, E. D., Walter, A. J., Hall, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+excised-leaf+assay+method+to+test+inoculativity+of+Asian+citrus+psyllid+(Hemiptera:+Psyllidae)+with+Candidatus+Liberibacter+asiaticus+associated+with+citrus+Huanglongbing+disease.">New excised-leaf assay method to test inoculativity of Asian citrus psyllid (Hemiptera: Psyllidae) with Candidatus Liberibacter asiaticus associated with citrus Huanglongbing disease.</a> Journal of Economic Entomology. 106 (1), 25-35 (2013).</li></ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten. Het gebruik van handels-, bedrijfs- of bedrijfsnamen in deze publicatie is ter informatie en gemak van de lezer. Een dergelijk gebruik vormt geen officiële goedkeuring of goedkeuring door het Amerikaanse ministerie van Landbouw of de Agricultural Research Service van een product of dienst met uitsluiting van andere die geschikt kunnen zijn. Het Amerikaanse ministerie van Landbouw (USDA) verbiedt discriminatie in al zijn programma's en activiteiten op basis van ras, huidskleur, nationale afkomst, leeftijd, handicap en, indien van toepassing, geslacht, burgerlijke staat, familiale status, ouderlijke status, religie, seksuele geaardheid, genetische informatie, politieke overtuigingen, represailles, of omdat het inkomen van een persoon geheel of gedeeltelijk is afgeleid van een openbaar hulpprogramma. Niet alle verboden bases zijn van toepassing op alle programma's. Personen met een handicap die alternatieve middelen nodig hebben voor de communicatie van programma-informatie (braille, grote letters, audiotape, enz.) moeten contact opnemen met het TARGET Center van USDA op (202) 720-2600 (spraak en TDD). Om een klacht over discriminatie in te dienen, schrijft u naar USDA, directeur, Office of Civil Rights, 1400 Independence Avenue, S.W., Washington, D.C. 20250-9410, of belt u (800) 795-3272 (stem) of (202) 720-6382 (TDD). USDA is een aanbieder van gelijke kansen en werkgever.

Om het DPI-apparaat te kunnen beschouwen als een levensvatbare methode voor exogene toediening van verbindingen in planten, moet het bijdragen aan een robuuste en consistente opname van verbindingen in verschillende weefseltypen. Het experiment met CFDA toonde duidelijk zowel acropetale als basipetale samengestelde beweging, evenals in zowel het vasculaire systeem als mesophylcellen van het blad. Bovendien, en vermoedelijk omdat het geboorde gat dat in dit DPI-apparaat wordt gebruikt een grote hoeveelheid oppervlak biedt voor samengestelde opname, was de CFDA in relatief gelijke hoeveelheden aanwezig in alle delen van de stengel, niet alleen in een kleine subset van de vasculatuur naast het apparaat, zoals is gezien in eerdere kleurstofopnamestudies in planten met behulp van staminjectie6. Bovendien werd de levering van groen fluorescerend eiwit en florale kleurstof getest met behulp van het DPI-apparaat en werd een verdeling van deze verbindingen vergelijkbaar met CFDA waargenomen (gegevens niet getoond). Deze gegevens suggereren dat het apparaat kan worden gebruikt om systemisch een verscheidenheid aan verbindingen af te leveren die variëren in grootte en moleculaire structuur. Het is echter vermeldenswaard dat er verschillen waren in de samengestelde opname op basis van de bladontwikkelingsfase, waarbij jongere ontwikkelende bladeren meer verbinding innamen dan oudere gevestigde bladeren. Dit kan te wijten zijn aan de veranderingen in de vasculatuureigenschappen die aanwezig zijn in zink- versus bronweefsel en moet worden geoptimaliseerd voor een bepaald experiment. 
Het DPI-apparaat vertoonde voldoende samengestelde opname voor de visualisatie van CFDA, GFP en florale kleurstof, en het nam ook genoeg in beslag om de antibacteriële en insecticide effecten van respectievelijk streptomycine en imidacloprid aan te tonen. Beide verbindingen resulteerden in veranderingen in de levensvatbaarheid van het doelorganisme 1 week na een enkele behandeling van 2,0 ml. Deze gegevens suggereren dat het DPI-apparaat kan worden gebruikt in tests voor de hele plant om de levensvatbaarheid van een breed scala aan verbindingen voor de bestrijding van microbiële en insectenplagen te testen. Bovendien kan dit apparaat, vanwege het directe contact met het vasculaire systeem, zelfs de mogelijkheid bieden om verbindingen te testen die niet efficiënt worden opgenomen door de wortels of epidermale cellen. Van bijzonder belang zou RNA-interferentie (RNAi) zijn, omdat dit kan worden gebruikt om de genexpressie in de waardplant, ziekteverwekker of pathogeenvector te moduleren. Eerder onderzoek dat haarspeld-RNA introduceerde via een geboord gat in de stam van appel- en druivenplanten toonde aan dat de RNA-moleculen beperkt waren tot het xyleemweefsel, wat suggereert dat deze moleculen mogelijk alleen effectief zijn tegen kauwende en xyleem-sapvoedende organismen22. Gezien het feit dat het DPI-apparaat een vergelijkbaar geboord gatafgiftesysteem gebruikt, is het logisch dat haarspeld-RNA dat met dit apparaat wordt geleverd, ook beperkt kan zijn tot het xyleemweefsel. De waargenomen afname van de titer van de floëembeperkte CLas na behandeling met streptomycine door het DPI-apparaat suggereert echter sterk dat dit antibioticum aanwezig was in het floëem. Daarom is het waarschijnlijk dat de vasculaire verdeling van de verbindingen die met behulp van het DPI-apparaat worden geleverd, afhankelijk is van hun grootte en chemie, en elk molecuul moet op individuele basis worden geëvalueerd.
Hoewel er een aantal in de handel verkrijgbare DPI-apparaten op de markt zijn, kan het hier beschreven apparaat in eigen huis worden vervaardigd en kan het worden gewijzigd. Op deze manier kunnen verbeteringen en veranderingen in grootte worden aangebracht op basis van de plantensoort en het experimentele ontwerp dat wordt gebruikt, en is het niet afhankelijk van commerciële producten. Bovendien is het apparaat semi-permanent aan de plant bevestigd, wat betekent dat meerdere behandelingen van een bepaalde verbinding tegelijkertijd kunnen worden uitgevoerd zonder de plant opnieuw te verwonden met meerdere samengestelde injecties. Waarschuwing: het apparaat kan lekken als het niet correct is geïnstalleerd. Als gevolg hiervan gaat de verbinding verloren aan het milieu in plaats van te worden afgeleverd aan de plant. Daarom moet ervoor worden gezorgd dat het apparaat tijdens de installatie en de eerste paar dagen daarna wordt geïnspecteerd op tekenen van lekkage. Hoewel het boren van een gat in de boom potentieel schadelijk is, is deze methode gekozen om een robuuste en consistente opname van verbindingen te garanderen. Bovendien werden in deze experimenten geen nadelige effecten op de gezondheid van planten waargenomen door de bevestiging van het DPI-apparaat. Er moeten echter extra planten in het experimentele ontwerp worden opgenomen om de planten te vervangen die in de loop van een bepaald experiment aan kracht kunnen inboeten. Ten slotte, aangezien dit apparaat passieve stroming gebruikt om verbindingen te introduceren, kan het moeilijk zijn om de opnamesnelheid van verschillende plantensoorten of ontwikkelingsstadia van dezelfde soort te voorspellen. Dit kan experimenten bemoeilijken als de snelheid van de opname van verbindingen een beperkende factor is. Voor de beste resultaten moeten experimenten zo worden gepland dat de plant voldoende tijd krijgt om de 2,5 ml verbinding volledig te absorberen, wat tot 1 week kan duren. Kortom, dit DPI-apparaat is een effectief hulpmiddel voor de snelle evaluatie van de in planta-activiteit van antimicrobiële of insecticide verbindingen tegen CLas en zijn vector, D. citri, en biedt dus meer informatie over de systemische effectiviteit en invloed op de prestaties van planten dan de eerder gepresenteerde losse bladtest23. Ongetwijfeld reikt de verscheidenheid aan toepassingen voor dit systeem veel verder dan de specifieke toepassingen die in deze studie worden beschreven.

Het beheer van planten in commerciële en landschappelijke omgevingen vereist vaak het gebruik van chemische verbindingen om de groei en gezondheid van de plant te optimaliseren. Hoe deze moleculen worden afgeleverd, hangt af van het type molecuul, de functie van het molecuul, het type plant en het aanwezige managementsysteem. Blad- en bodemtoepassingen zijn de gemakkelijkste afgiftestrategieën, maar beperkingen in de opname van sommige moleculen vereisen directe levering. Een voorbeeld van deze moleculen zijn therapeutische moleculen die het beste functioneren wanneer ze systemisch in de plant bewegen, maar niet effectief kunnen worden geleverd door eenvoudige actuele toepassingen1. Dit is het geval bij Huanglongbing (HLB), ook wel citrus greening disease genoemd. HLB is een ziekte geassocieerd met een floëem-beperkte bacterie, Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), die niet buiten de plant kan worden gekweekt, of zijn insectenvector, Diaphorina citri Kuwayama (D. citri)2.
Als de vermeende therapeutische moleculen genproducten zijn, kunnen ze worden getest door transgene planten te maken die deze verbindingen tot expressie brengen. Transgene plantaardige productie kan echter tijd- en hulpbronnenintensief zijn, is sterk genotype-afhankelijk en kan worden geremd door gen-uitschakeling3. Bovendien, zelfs als deze transgenen veelbelovende resultaten laten zien, verminderen beperkingen op het gebied van regelgeving en publieke perceptie de kans op commerciële acceptatie 4,5. De exogene toepassing van verbindingen vereenvoudigt echter het testen van biologische en synthetische moleculen omdat het niet de productie van stabiele of tijdelijk tot expressie brengende transgene planten vereist, wat de tijd en middelen voor het testen van de effecten van een molecuul vermindert. Een methode voor de effectieve en efficiënte systemische levering van exogene verbindingen door planten kan worden gebruikt voor een breed scala aan onderzoeks- en screeningsdoeleinden.
Een van deze toepassingen is de analyse van systemische molecuulbewegingen binnen het vasculaire systeem van een plant, die kan worden gedaan met behulp van traceerbare markers, of het nu fluorescerende, zichtbare of unieke chemische isotopenzijn 6,7,8,9. Een veelgebruikte fluorescerende marker is 5,6-carboxyfluoresceïne-diacetaat (CFDA), een membraandoorlatende kleurstof die door intracellulaire esterasen wordt afgebroken tot 5,6-carboxyfluoresceïne (CF) en vervolgens fluorescerend en membraanondoordringbaarwordt 10. CFDA is op grote schaal gebruikt om floëemtransport, zink- en bronrelaties en vasculatuurpatronen in plantenweefsel te monitoren11,12.
Naast deze markers kunnen bepaalde verbindingen de fysiologie van de plant direct veranderen om de productiviteit te verhogen of de plant te doden in het geval van herbiciden. Zowel insecticiden als antimicrobiële verbindingen zijn een middel om de productiviteit van planten te verhogen, vooral in de aanwezigheid van HLB. Een voorbeeld van een antimicrobieel molecuul dat wordt gebruikt om CLas te beheersen is streptomycine. Streptomycine is een aminoglycoside-antibioticum dat oorspronkelijk werd geïsoleerd uit Streptomyces griseus en waarvan is aangetoond dat het de bacteriegroei remt door de remming van eiwitbiosynthese13. In termen van insecticiden is het belangrijkste doelwit voor HLB-onderzoek D. citri, dat CLas van boom naar boom14 overbrengt. Voor dit doel worden neonicotinoïden, zoals imidacloprid, vaak gebruikt, omdat ze de gouden standaard zijn voor het bestrijden van insectenplagen15. Al deze uiteenlopende toepassingen zijn belangrijke aspecten van de huidige strategieën voor plantbeheer en de ontwikkeling van nieuwe producten is afhankelijk van efficiënte screeningtests.
Een methode die wordt gebruikt voor de introductie van verbindingen in houtachtige planten is directe injectie in de stam. Er zijn verschillende systemen ontworpen die variëren in hun behoeften voor voorgeboorde injectieplaatsen, en deze systemen maken gebruik van op druk gebaseerde injectie of passieve stroom16. Hoewel op druk gebaseerde systemen de snelle introductie van een bepaalde verbinding mogelijk maken, moet de potentiële fysieke schade die wordt veroorzaakt door het forceren van vloeistof door geblokkeerde of geëmboliseerde vasculatuur worden beschouwd17. Hoewel de blad- of drenktoepassing van verbindingen minder tijdsintensief is om te implementeren, vermindert directe planteninjectie de verspilling van de verbinding van belang als gevolg van verliezen aan de lucht of de bodem en kan het ook de tijd verlengen dat verbindingen zich in een actieve toestand bevinden door de blootstelling aan de buitenomgeving te verminderen18. Beide aspecten zijn belangrijk voor het behoud van dure reagentia en het waarborgen van consistentie tussen replicaties in onderzoeksomgevingen.
Deze studie beschrijft het ontwerp, de constructie en het gebruik van een innovatief direct plant infusion (DPI) -apparaat, dat kan worden gebruikt om te beoordelen hoe interessante verbindingen een waardplant beïnvloeden. Een standaard 3D-printer werd gebruikt om zowel het apparaat zelf als verschillende componenten in verband met de constructie te vervaardigen. Deze interne bouwmethode stelt onderzoekers in staat om het apparaat en de apparaatcomponenten aan te passen op basis van hun specifieke experimentele behoeften en vermindert de afhankelijkheid van commercieel verkrijgbare installatie-injectieapparaten. De installatie van het apparaat is eenvoudig en efficiënt en alle hulpcomponenten zijn direct beschikbaar en goedkoop. Hoewel het systeem is ontworpen voor gebruik met een verscheidenheid aan plantensoorten, hebben de hier gepresenteerde voorbeelden betrekking op citrusplanten in pot. Bovendien toont deze studie aan dat dit apparaat in staat is om efficiënt meerdere soorten verbindingen systemisch aan jonge citrusplanten te leveren zonder dodelijkheid te veroorzaken. De geteste verbindingen omvatten CFDA, dat werd gebruikt om de stofverdeling in de plant te beoordelen, en streptomycine en imidacloprid, die werden gebruikt om te verifiëren dat de antimicrobiële en insecticide effecten van deze verbindingen werden waargenomen wanneer ze via DPI werden toegediend.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 cm Diameter Steel Balls</td>
			<td>Ballistic Products Inc.</td>
			<td>#SHT #T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>382903029952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G 1 Syringe Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Screw Cap Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1420-9710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/32nd Inch Black Oxide Drill Bit</td>
			<td>Sears</td>
			<td>964077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Printer</td>
			<td>Markforged</td>
			<td>F-PR-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Printing Software</td>
			<td>Markforged</td>
			<td>F-SW-FDVX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Printing Software</td>
			<td>Markforged</td>
			<td>S-FW-OEVX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(6)-CFDA (5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5/64th Inch Black Oxide Drill Bit</td>
			<td>Sears</td>
			<td>964502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well qPCR Machine</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22621408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SP-BX43-BI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>69401-ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloss Clear Spray Paint</td>
			<td>Rustoleum</td>
			<td>249117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grey Lego Baseplate</td>
			<td>Lego</td>
			<td>11024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld Cordless Drill</td>
			<td>Makita</td>
			<td>6349D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidacloprid 2F</td>
			<td>Quali-Pro</td>
			<td>83080133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Plastisol Medium Hardness</td>
			<td>Fusion X Fishing Lures</td>
			<td>XSOL-505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Silicone 70 Shore A O-Ring</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>Varies by Size</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Stick Cooking Spray</td>
			<td>PAM</td>
			<td>64144030217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Plant II</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740770.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>HS234526A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly Viyl Acetate Based Glue</td>
			<td>Elmers</td>
			<td>E301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Master Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A6001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Varies by DNA sequence</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A5003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Razor Blade</td>
			<td>Garvey</td>
			<td>40475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent Silicone RTV Rubber</td>
			<td>Aero Marine Products</td>
			<td>AM 115T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent Silicone Tape</td>
			<td>Maxwell</td>
			<td>KE30S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Truncated Oncocin 112</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Varies by peptide sequence</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White 1 x 6 Lego Piece</td>
			<td>Lego</td>
			<td>300901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Nylon</td>
			<td>Markforged</td>
			<td>F-MF-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct infusion device for molecule delivery in plants

Het testen van de functie van therapeutische verbindingen in planten is een belangrijk onderdeel van landbouwkundig onderzoek. Blad- en bodemdoordrenkmethoden zijn routineus, maar hebben nadelen, waaronder variabele opname en de omgevingsafbraak van geteste moleculen. Staminjectie van bomen is goed ingeburgerd, maar de meeste methoden hiervoor vereisen dure, eigen apparatuur. Om verschillende behandelingen voor Huanglongbing te screenen, is een eenvoudige, goedkope methode nodig om deze verbindingen af te leveren aan het vaatweefsel van kleine in de kas gekweekte citrusbomen die zijn geïnfecteerd met de floëembeperkte bacterie Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) of besmet met de floëemvoedende CLas-insectenvector Diaphorina citri Kuwayama (D. citri).
Om aan deze screeningsvereisten te voldoen, is een direct plant infusion (DPI) -apparaat ontworpen dat verbinding maakt met de stam van de plant. Het apparaat is gemaakt met behulp van een op nylon gebaseerd 3D-printsysteem en gemakkelijk verkrijgbare hulpcomponenten. De werkzaamheid van dit apparaat werd getest in citrusplanten met behulp van de fluorescerende marker 5,6-carboxyfluoresceïne-diacetaat. Uniforme samengestelde verdeling van de marker over de planten werd routinematig waargenomen.
Bovendien werd dit apparaat gebruikt om antimicrobiële en insecticide moleculen af te leveren om hun effecten op respectievelijk CLas en D. citri te bepalen. Het aminoglycoside-antibioticum streptomycine werd met behulp van het apparaat afgeleverd in CLas-geïnfecteerde citrusplanten, wat resulteerde in een vermindering van de CLas-titer van 2 weken tot 4 weken na de behandeling. Het afleveren van het neonicotinoïde insecticide imidacloprid in D. citri-besmette citrusplanten resulteerde in een significante toename van psyllidensterfte na 7 dagen . Deze resultaten suggereren dat dit DPI-apparaat een nuttig systeem vertegenwoordigt voor het leveren van moleculen in planten voor het testen en het vergemakkelijken van onderzoeks- en screeningsdoeleinden.

The management of plants in commercial and landscape settings often requires the use of chemical compounds to optimize the plant growth and health. How these molecules are delivered depends on the type of molecule, the function of the molecule, the type of plant, and the management system in place. Foliar and soil applications are the easiest delivery strategies, but limitations in the uptake of some molecules necessitate direct delivery. An example of these molecules is therapeutic molecules that function best when they move systemically within the plant but cannot be effectively delivered by simple topical applications1. This is the case with Huanglongbing (HLB), also called citrus greening disease. HLB is a disease associated with a phloem-limited bacterium, Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), which cannot be cultured outside of the plant, or its insect vector, Diaphorina citri Kuwayama (D. citri)2.
If the putative therapeutic molecules are gene products, they can be tested by creating transgenic plants expressing these compounds. However, transgenic plant production can be time- and resource-intensive, is highly genotype-dependent, and can be inhibited by gene silencing3. In addition, even if these transgenics show promising results, regulatory and public perception constraints reduce the likelihood of their commercial acceptance4,5. The exogenous application of compounds, however, simplifies the testing of biological and synthetic molecules because it does not require the production of stable or transiently expressing transgenic plants, which reduces the time and resources for testing a molecule&#39;s effects. A method for the effective and efficient systemic plant delivery of exogenous compounds could be used for a wide variety of research and screening purposes.
One of these applications is the analysis of systemic molecule movement within a plant&#39;s vascular system, which can be done using trackable markers, whether they are fluorescent, visible, or unique chemical isotopes6,7,8,9. One commonly used fluorescent marker is 5,6-carboxyfluorescein-diacetate (CFDA), which is a membrane-permeable dye that is degraded by intracellular esterases into 5,6-carboxyfluorescein (CF) and, subsequently, becomes fluorescent and membrane-impermeable10. CFDA has been extensively used to monitor phloem transport, sink and source relationships, and vasculature patterning in plant tissue11,12.
In addition to these markers, certain compounds may directly alter the plant&#39;s physiology to increase the productivity or kill the plant in the case of herbicides. Both insecticides and antimicrobial compounds are a means of increasing plant productivity, especially in the presence of HLB. An example of an antimicrobial molecule that is used to control CLas is streptomycin. Streptomycin is an aminoglycoside antibiotic that was originally isolated from Streptomyces griseus and has been shown to inhibit bacterial growth through the inhibition of protein biosynthesis13. In terms of insecticides, the main target for HLB research is D. citri, which transmits CLas from tree to tree14. For this purpose, neonicotinoids, such as imidacloprid, are commonly utilized, as they are the gold standard for controlling insect pests15. All these varied uses are important aspects of current plant management strategies, and the development of novel products is dependent on efficient screening assays.
One method that is used for the introduction of compounds into woody plants is direct injection into the trunk. A variety of systems have been designed that vary in their needs for predrilled injection sites, and these systems utilize either pressure-based injection or passive flow16. Although pressure-based systems allow for the quick introduction of a given compound, the potential physical damage caused by forcing liquid through blocked or embolized vasculature needs to be considered17. Although the foliar or drench application of compounds is less time-intensive to implement, direct plant injection reduces waste of the compound of interest due to losses to the air or soil and can also lengthen the time that compounds are in an active state by reducing the exposure to the outside environment18. Both these aspects are important for preserving expensive reagents and ensuring consistency among replicates in research settings.
This study describes the design, construction, and use of an innovative direct plant infusion (DPI) device, which can be used to assess how compounds of interest affect a host plant. A standard 3D printer was used to manufacture both the device itself and several components associated with its construction. This in-house construction method allows researchers to modify the device and device components based on their specific experimental needs and reduces the reliance on commercially available plant injection devices. The device setup is simple and efficient, and all the auxiliary components are readily available and inexpensive. Although the system was designed for use with a variety of plant species, the examples presented here pertain to potted citrus plants. Additionally, this study demonstrates that this device is capable of efficiently delivering multiple types of compounds systemically to young citrus plants without causing lethality. The compounds tested included CFDA, which was used to assess the compound distribution in the plant, and streptomycin and imidacloprid, which were used to verify that the antimicrobial and insecticidal effects of these compounds were observed when delivered via DPI.

Auteur in de schijnwerpers: Direct infuusapparaat voor molecuulafgifte in planten  

Direct infuusapparaat voor molecuulafgifte in planten

Delivering a therapeutic molecule to where a pathogen resides in a plant can be challenging. Treating Candidatus Liberibacter asiaticus, or CLas, a bacteria that is limited to the phloem, poses one of the biggest challenges in delivering molecules against it, especially when using conventional methods such as spray applications. The ease of printing the direct plant infusion device and its simple implementation makes it accessible to anyone.This enables the widespread screening of molecules for their potential therapeutic effect in trees. An added benefit is that the diffusion of molecules utilizes the natural process of plant transpiration. Our research improved efficiency and precision of molecular delivery in plants, which can be used for a range of research applications.By screening hundreds of molecules on small plants, we can eliminate the need for larger trees, leading to a reduction in cost and space utilization.

Watch this Scientific Journal Video about Direct Infusion Device for Molecule Delivery in Plants at JoVE.com

Dit manuscript beschrijft een nieuw direct planteninfuusapparaat voor het screenen van de effectiviteit van moleculen tegen de bacteriën (Candidatus Liberibacter asiaticus) of zijn insectenvector (Diaphorina citri, Kuwayama) die, in combinatie, geassocieerd zijn met Huanglongbing citrusziekte.

Testing the function of therapeutic compounds in plants is an important component of agricultural research. Foliar and soil-drench methods are routine but ...

Het afleveren van een therapeutisch molecuul aan waar een pathogeen zich in een plant bevindt, kan een uitdaging zijn. De behandeling van Candidatus Liberibacter asiaticus, of CLas, een bacterie die beperkt is tot het floëem, vormt een van de grootste uitdagingen bij het leveren van moleculen ertegen, vooral bij het gebruik van conventionele methoden zoals spraytoepassingen. Het gemak van het printen van het directe installatie-infuusapparaat en de eenvoudige implementatie ervan maakt het voor iedereen toegankelijk.Dit maakt de wijdverspreide screening van moleculen op hun potentiële therapeutische effect in bomen mogelijk. Een bijkomend voordeel is dat de diffusie van moleculen gebruik maakt van het natuurlijke proces van plantentranspiratie. Ons onderzoek verbeterde de efficiëntie en precisie van moleculaire toediening in planten, die kan worden gebruikt voor een reeks onderzoekstoepassingen.Door honderden moleculen op kleine planten te screenen, kunnen we de behoefte aan grotere bomen elimineren, wat leidt tot een vermindering van de kosten en het ruimtegebruik.

Direct infuusapparaat voor molecuulafgifte in planten

Abstract