Analyse af fluorescerende farvede lipiddråber med 3D-rekonstruktion til vurdering af hepatisk steatose

Lipiddråber (LD'er) er specialiserede organeller, der formidler lipidopbevaring og spiller en meget vigtig rolle i undertrykkelse af lipotoksicitet og forebyggelse af dysfunktion forårsaget af frie fedtsyrer (FA'er). Leveren, givet sin kritiske rolle i kroppens fedtstofskifte, er vedvarende truet af den intracellulære akkumulering af LD'er i form af både mikrovesikulær og makrovesikulær hepatisk steatose. Den histologiske karakterisering af LD'er er typisk baseret på lipidopløselige diazofarvestoffer, såsom Oil Red O (ORO) farvning, men en række ulemper hæmmer konsekvent brugen af denne analyse med leverprøver. For nylig er lipofile fluoroforer 493/503 blevet populære til visualisering og lokalisering af LD'er på grund af deres hurtige optagelse og ophobning i den neutrale lipiddråbekerne. Selvom de fleste anvendelser er velbeskrevne i cellekulturer, er der mindre beviser, der viser pålidelig anvendelse af lipofile fluoroforprober som et LD-billeddannelsesværktøj i vævsprøver. Heri foreslår vi en optimeret bordipyrromethen (BODIPY) 493/503-baseret protokol til evaluering af LD'er i leverprøver fra en dyremodel af fedtfattig diæt (HFD)-induceret hepatisk steatose. Denne protokol dækker forberedelse af leverprøver, vævssektionering, BODIPY 493/503-farvning, billedoptagelse og dataanalyse. Vi demonstrerer et øget antal, intensitet, arealforhold og diameter af hepatiske LD'er ved HFD-fodring. Ved hjælp af ortogonale projektioner og 3D-rekonstruktioner var det muligt at observere det fulde indhold af neutrale lipider i LD-kernen, der fremstod som næsten sfæriske dråber. Desuden var vi med fluoroforen BODIPY 493/503 i stand til at skelne mikrovesikler (1 μm < d ≤ 3 μm), mellemliggende vesikler (3 μm < d ≤ 9 μm) og makrovesikler (d > 9 μm), hvilket muliggjorde en vellykket diskrimination af mikrovesikulær og makrovesikulær steatose. Samlet set er denne BODIPY 493/503 fluorescensbaserede protokol et pålideligt og simpelt værktøj til hepatisk LD-karakterisering og kan repræsentere en komplementær tilgang til de klassiske histologiske protokoller.