Analyse af fluorescerende farvede lipiddråber med 3D-rekonstruktion til vurdering af hepatisk steatose

Summary

Heri demonstrerer vi en optimeret BODIPY 493/503 fluorescensbaseret protokol til lipiddråbekarakterisering i levervæv. Gennem brug af ortogonale projektioner og 3D-rekonstruktioner muliggør fluoroforen en vellykket skelnen mellem mikrovesikulær og makrovesikulær steatose og kan repræsentere en komplementær tilgang til de klassiske histologiske protokoller til vurdering af hepatisk steatose.

Abstract

Lipiddråber (LD'er) er specialiserede organeller, der formidler lipidopbevaring og spiller en meget vigtig rolle i undertrykkelse af lipotoksicitet og forebyggelse af dysfunktion forårsaget af frie fedtsyrer (FA'er). Leveren, givet sin kritiske rolle i kroppens fedtstofskifte, er vedvarende truet af den intracellulære akkumulering af LD'er i form af både mikrovesikulær og makrovesikulær hepatisk steatose. Den histologiske karakterisering af LD'er er typisk baseret på lipidopløselige diazofarvestoffer, såsom Oil Red O (ORO) farvning, men en række ulemper hæmmer konsekvent brugen af denne analyse med leverprøver. For nylig er lipofile fluoroforer 493/503 blevet populære til visualisering og lokalisering af LD'er på grund af deres hurtige optagelse og ophobning i den neutrale lipiddråbekerne. Selvom de fleste anvendelser er velbeskrevne i cellekulturer, er der mindre beviser, der viser pålidelig anvendelse af lipofile fluoroforprober som et LD-billeddannelsesværktøj i vævsprøver. Heri foreslår vi en optimeret bordipyrromethen (BODIPY) 493/503-baseret protokol til evaluering af LD'er i leverprøver fra en dyremodel af fedtfattig diæt (HFD)-induceret hepatisk steatose. Denne protokol dækker forberedelse af leverprøver, vævssektionering, BODIPY 493/503-farvning, billedoptagelse og dataanalyse. Vi demonstrerer et øget antal, intensitet, arealforhold og diameter af hepatiske LD'er ved HFD-fodring. Ved hjælp af ortogonale projektioner og 3D-rekonstruktioner var det muligt at observere det fulde indhold af neutrale lipider i LD-kernen, der fremstod som næsten sfæriske dråber. Desuden var vi med fluoroforen BODIPY 493/503 i stand til at skelne mikrovesikler (1 μm < d ≤ 3 μm), mellemliggende vesikler (3 μm < d ≤ 9 μm) og makrovesikler (d > 9 μm), hvilket muliggjorde en vellykket diskrimination af mikrovesikulær og makrovesikulær steatose. Samlet set er denne BODIPY 493/503 fluorescensbaserede protokol et pålideligt og simpelt værktøj til hepatisk LD-karakterisering og kan repræsentere en komplementær tilgang til de klassiske histologiske protokoller.

Introduction

Lipiddråber (LD'er), der klassisk betragtes som energidepoter, er specialiserede cellulære organeller, der formidler lipidlagring, og de omfatter en hydrofob neutral lipidkerne, som hovedsageligt indeholder kolesterolestere og triglycerider (TG'er), indkapslet af et phospholipidmonolag ^1,2,3.

LD-biogenese forekommer i det endoplasmatiske retikulum (ER), begyndende med syntesen af triacylglycerol (TAG) og sterolestere. Neutrale lipider diffunderes mellem folderne i ER-dobbeltlaget ved lave koncentrationer, men samles i olielinser, der vokser og knop....

Protocol

Alle dyreforsøg udført i denne undersøgelse blev godkendt af Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR) Animal Welfare Body (ORBEA, #9/2018) og overholdt Animal Care National og European Directive og ARRIVE-retningslinjerne.

1. Eksperimentelt design

1. Parvis 13 uger gamle Wistar-hanrotter i ventilerede bure under kontrollerede miljøforhold med temperatur (22 °C ± 1 °C), fugtighed (50%-60%) og lys (12 timers lys-mørk cyklus) og med ad libitum adgang til postevand og standard gnaverchow.
2. Efter en 2 ugers periode med akklimatisering tildeler rotterne vilkårligt i to grupper.
....

Discussion

Denne BODIPY 493/503 fluorescensbaserede protokol til LD-vurdering havde til formål at udvikle en ny billeddannelsesmetode til evaluering af hepatisk steatose. I betragtning af den stærke sammenhæng mellem fedme og fedtleversygdom blev den vestlige diæt med højt fedtindhold brugt til at etablere en dyremodel for hepatisk steatose²⁶. En robust stigning i hepatisk TG-indhold blev bekræftet af et kvantitativt triglycerider kolorimetrisk assaykit, som foreslog et forhøjet hepatisk lipidosescena.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set	Fisher Scientific
4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	D3922
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR	D1306
70% ethanol	Honeywell	10191455
Adobe Illustrator CC	Adobe Inc.	Used to design the figures
Automatic analyzer Hitachi 717	Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany	8177-30-0010
Barrier pen (Liquid blocker super pap pen)	Daido Sangyo Co., Ltd, Japon	_
Blade	Leica	221052145	Used in the cryostat
Cell Profiler version 4.2.5	https://cellprofiler.org/releases/	Used to analyse the acquired images
Coverslips	Menzel-Glaser, Germany	_
Cryomolds	Tissue-Tek	_
Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S	Leica Biosystems	_
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	D-8418	Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Dry ice container (styrofoam cooler)	Novolab	A26742
Dumont forceps	Fine Science Tools, Germany	11295-10
Glass Petri dish (H 25 mm, ø 150 mm)	Thermo Scientific	150318	Used to weigh the liver after dissection
Glycergel	DAKO Omnis	S303023
GraphPad Prism software, version 9.3.1	GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA
High-fat diet	Envigo, Barcelona, Spain	MD.08811
Ketamine (Nimatek  100 mg/mL)	Dechra	791/01/14DFVPT	Used at a final concentration of 75 mg/kg
Laser scanning confocal microscope  (QUASAR detection unit; )	Carl Zeiss, germany	LSM 710 Axio Observer Z1 microscope
Medetomidine (Sedator 1 mg/mL)	Dechra	1838 ESP / 020/01/07RFVPT	Used at a final concentration of 1 mg/kg
Needle	BD microlance	300635
No 15 Sterile carbon steel scalpel Blade	Swann-Morton	205
Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil)	Carl Zeiss, Germany
Paint brushes	Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X	Used to handle cryosections
Peristaltic pump (Minipuls 3)	Gilson	1004170
Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	P3813
Scalpel handle, 125 mm (5"), No. 3	Swann-Morton	0208
Slide staining system StainTray	Simport Scientific	M920
Standard diet	Mucedola	4RF21
Superfrost Plus microscope slides	Menzel-Glaser, Germany	J1800AMNZ
Tissue-Tek OCT mounting media	VWR CHEMICALS	361603E
Triglycerides colorimetric assay kit	Cayman Chemical	10010303
Ultrasonic bath	Bandelin Sonorex	TK 52
Vannas spring scissors - 3 mm cutting edge	Fine Science Tools, Germany	15000-00
ZEN Black software	Zeiss