肝脂肪症評価のための3D再構成による蛍光染色された脂肪滴の分析

要約

ここでは、肝臓組織における脂肪滴の特性評価に最適化されたBODIPY 493/503蛍光ベースのプロトコルを示します。直交投影と3D再構成を使用することにより、蛍光色素は微小小胞性脂肪症と大水疱性脂肪症の識別に成功し、肝脂肪症評価のための古典的な組織学的プロトコルへの補完的なアプローチを表す可能性があります。

要約

脂肪滴(LD)は、脂質貯蔵を媒介する特殊な細胞小器官であり、脂肪毒性の抑制や遊離脂肪酸(FA)による機能障害の予防に非常に重要な役割を果たしています。肝臓は、体の脂肪代謝におけるその重要な役割を考えると、小胞性および大小胞性肝脂肪症の両方の形でのLDの細胞内蓄積によって持続的に脅かされています。LDの組織学的特性評価は、通常、オイルレッドO(ORO)染色などの脂溶性ジアゾ色素に基づいていますが、多くの欠点が肝臓標本でのこの分析の使用を一貫して妨げています。最近では、親油性蛍光色素493/503は、中性脂肪滴コアへの迅速な取り込みと蓄積により、LDの可視化と位置特定に一般的になっています。ほとんどのアプリケーションは細胞培養で十分に説明されていますが、組織サンプルにおけるLDイメージングツールとしての親油性蛍光色素プローブの信頼性の高い使用を実証する証拠はほとんどありません。ここでは、最適化されたホウ素ジピロメテン(BODIPY)493/503ベースのプロトコルを提案します 高脂肪食(HFD)誘発肝脂肪症の動物モデルからの肝臓検体中のLDの評価。このプロトコルは、肝臓サンプル調製、組織切片作成、BODIPY 493/503染色、画像取得、およびデータ分析をカバーしています。HFD給餌時の肝LDの数、強度、面積比、および直径の増加を示しています。直交投影と3D再構成を使用して、ほぼ球形の液滴として現れるLDコアの中性脂質の完全な含有量を観察することができました。さらに、蛍光色素BODIPY 493/503では、マイクロベシクル(1 μm < d ≤ 3 μm)、中間小胞(3 μm < d ≤ 9 μm)、マクロベシクル(d > 9 μm)を区別することができ、微小小胞および大小胞脂肪症の識別に成功しました。全体として、このBODIPY 493/503蛍光ベースのプロトコルは、肝臓LDの特性評価のための信頼性が高くシンプルなツールであり、古典的な組織学的プロトコルに対する補完的なアプローチを表す可能性があります。

概要

古典的にエネルギー貯蔵庫と見なされる脂肪滴(LD)は、脂質貯蔵を媒介する特殊な細胞小器官であり、リン脂質単層^1,2,3によってカプセル化されたコレステロールエステルおよびトリグリセリド(TG)を主成分とする疎水性の中性脂質コアを含む。

LD生合成は、トリアシルグリセロール(TAG)およびステロールエステルの合成から始めて、小胞体(ER)で起こる。中性脂質は、低濃度では小胞体二重層の小葉の間に拡散しますが、細胞内濃度が増加すると、小胞体膜からほぼ球形の液滴に成長して発芽する油レンズに合体します⁴。続いて、ER二重層およびサイトゾルからのタンパク質、特にペリリピン(PLIN)タンパク質ファミリーがLDの表面に移行し、出芽を促進します⁵、⁶、⁷、^8、9。

新しい脂肪酸合成と....

プロトコル

この研究で実施されたすべての動物の手順は、コインブラ臨床生物医学研究所(iCBR)の動物福祉団体(ORBEA、#9/2018)によって承認され、アニマルケア国内および欧州指令およびARRIVEガイドラインに準拠しています。

1. 実験計画

1. ペアハウス13週齢のオスのWistarラットを、温度(22°C±1°C)、湿度(50%-60%)、および明るい(12時間の明暗サイクル)の制御された環境条件下で、水道水と標準的なげっ歯類の飼料への 自由 アクセス。
2. 2週間の順応期間の後、ラットを任意に2つのグループに割り当てる。
3. 対照群(CTRL、n = 6)および高脂肪食群(HFD、n = 6)に、それぞれ標準飼料および高脂肪食(45%kcal /脂肪)を24週間給餌する。
4. 毎週体重(BW)を監視します。ケージごとに毎日食べ物と飲み物の消費量を記録します。

2.肝臓サンプル調製

1. 肝解離
   1. 蠕動ポンプの準備:70%エタノールをチューブに通し、27 Gの針をチューブの出口端に接続し、氷冷(4°C)1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH~7.4)でチューブをプライミングします(たとえば、内径1.6 mmのシリコンチューブを備えた蠕動....

結果

この手法の実行に成功すると、LD形態(3D再構成に基づく形状と脂質コア密度)とその空間分布、総面積あたりの数、および平均サイズ(上記のパイプラインで評価、 図1)を同時に特性評価するための明確な脂肪滴染色が得られるはずです。

?.......

ディスカッション

この BODIPY 493/503 LD評価用蛍光ベースのプロトコルは、肝脂肪症の評価のための新しいイメージングアプローチを開発することを目的としていました。肥満と脂肪肝疾患との強い相関を考慮して、西洋式の高脂肪食を使用して肝脂肪症の動物モデルを確立しました²⁶。肝TG含有量の力強い増加は、定量的トリグリセリド比色アッセイキットによって確認され、HFD給餌動物におけ.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set	Fisher Scientific
4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	D3922
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR	D1306
70% ethanol	Honeywell	10191455
Adobe Illustrator CC	Adobe Inc.	Used to design the figures
Automatic analyzer Hitachi 717	Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany	8177-30-0010
Barrier pen (Liquid blocker super pap pen)	Daido Sangyo Co., Ltd, Japon	_
Blade	Leica	221052145	Used in the cryostat
Cell Profiler version 4.2.5	https://cellprofiler.org/releases/	Used to analyse the acquired images
Coverslips	Menzel-Glaser, Germany	_
Cryomolds	Tissue-Tek	_
Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S	Leica Biosystems	_
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	D-8418	Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Dry ice container (styrofoam cooler)	Novolab	A26742
Dumont forceps	Fine Science Tools, Germany	11295-10
Glass Petri dish (H 25 mm, ø 150 mm)	Thermo Scientific	150318	Used to weigh the liver after dissection
Glycergel	DAKO Omnis	S303023
GraphPad Prism software, version 9.3.1	GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA
High-fat diet	Envigo, Barcelona, Spain	MD.08811
Ketamine (Nimatek  100 mg/mL)	Dechra	791/01/14DFVPT	Used at a final concentration of 75 mg/kg
Laser scanning confocal microscope  (QUASAR detection unit; )	Carl Zeiss, germany	LSM 710 Axio Observer Z1 microscope
Medetomidine (Sedator 1 mg/mL)	Dechra	1838 ESP / 020/01/07RFVPT	Used at a final concentration of 1 mg/kg
Needle	BD microlance	300635
No 15 Sterile carbon steel scalpel Blade	Swann-Morton	205
Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil)	Carl Zeiss, Germany
Paint brushes	Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X	Used to handle cryosections
Peristaltic pump (Minipuls 3)	Gilson	1004170
Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	P3813
Scalpel handle, 125 mm (5"), No. 3	Swann-Morton	0208
Slide staining system StainTray	Simport Scientific	M920
Standard diet	Mucedola	4RF21
Superfrost Plus microscope slides	Menzel-Glaser, Germany	J1800AMNZ
Tissue-Tek OCT mounting media	VWR CHEMICALS	361603E
Triglycerides colorimetric assay kit	Cayman Chemical	10010303
Ultrasonic bath	Bandelin Sonorex	TK 52
Vannas spring scissors - 3 mm cutting edge	Fine Science Tools, Germany	15000-00
ZEN Black software	Zeiss