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Neste artigo, demonstramos um protocolo otimizado baseado em fluorescência BODIPY 493/503 para caracterização de gotículas lipídicas em tecido hepático. Através do uso de projeções ortogonais e reconstruções 3D, o fluoróforo permite o sucesso da discriminação entre esteatose microvesicular e macrovesicular e pode representar uma abordagem complementar aos protocolos histológicos clássicos para avaliação da esteatose hepática.
As gotículas lipídicas (DLs) são organelas especializadas que medeiam o armazenamento lipídico e desempenham um papel muito importante na supressão da lipotoxicidade e na prevenção da disfunção causada pelos ácidos graxos livres (AGs). O fígado, dado seu papel crítico no metabolismo da gordura do corpo, é persistentemente ameaçado pelo acúmulo intracelular de DLs na forma de esteatose hepática microvesicular e macrovesicular. A caracterização histológica dos LDs é tipicamente baseada em corantes diazo lipossolúveis, como a coloração Oil Red O (ORO), mas uma série de desvantagens consistentemente dificulta o uso dessa análise com espécimes hepáticos. Mais recentemente, os fluoróforos lipofílicos 493/503 tornaram-se populares para visualizar e localizar DLs devido à sua rápida captação e acúmulo no núcleo de gotículas lipídicas neutras. Embora a maioria das aplicações seja bem descrita em culturas celulares, há menos evidências demonstrando o uso confiável de sondas de fluoróforo lipofílico como uma ferramenta de imagem de DL em amostras de tecido. Neste trabalho, propomos um protocolo otimizado baseado em dipirrometeno de boro (BODIPY) 493/503 para a avaliação de DLs em espécimes hepáticos de um modelo animal de esteatose hepática induzida por dieta hiperlipídica (DHL). Este protocolo abrange preparo de amostras de fígado, secção tecidual, coloração BODIPY 493/503, aquisição de imagens e análise de dados. Demonstramos um aumento do número, intensidade, razão de área e diâmetro das DLs hepáticas após a alimentação com DH. Usando projeções ortogonais e reconstruções 3D, foi possível observar o conteúdo total de lipídios neutros no núcleo LD, que apareceu como gotículas quase esféricas. Além disso, com o fluoróforo BODIPY 493/503, conseguimos distinguir microvesículas (1 μm < d ≤ 3 μm), vesículas intermediárias (3 μm < d ≤ 9 μm) e macrovesículas (d > 9 μm), permitindo a discriminação bem sucedida da esteatose microvesicular e macrovesicular. Em geral, este protocolo baseado em fluorescência BODIPY 493/503 é uma ferramenta confiável e simples para a caracterização da DL hepática e pode representar uma abordagem complementar aos protocolos histológicos clássicos.
As gotículas lipídicas (DLs), classicamente vistas como depósitos de energia, são organelas celulares especializadas que medeiam o armazenamento lipídico e compreendem um núcleo lipídico neutro hidrofóbico, que contém principalmente ésteres de colesterol e triglicérides (TGs), encapsulados por uma monocamada fosfolipídica 1,2,3.
A biogênese da DL ocorre no retículo endoplasmático (RE), iniciando-se com a síntese de triacilgliceróis (TAG) e ésteres esteróis. Os lipídios neutros são difundidos entre os folíolos da bicamada de RE em baixas concentraçõ....
Todos os procedimentos em animais realizados neste estudo foram aprovados pelo Instituto Coimbra de Investigação Clínica e Biomédica (iCBR) Animal Welfare Body (ORBEA, #9/2018) e cumpriram as diretivas nacionais e europeias de cuidados com animais e as diretrizes ARRIVE.
1. Delineamento experimental
A execução bem-sucedida desta técnica deve resultar em coloração clara de gotículas lipídicas para a caracterização simultânea da morfologia da DL (forma e densidade do núcleo lipídico com base na reconstrução 3D), juntamente com sua distribuição espacial, número por área total e tamanho médio (avaliado com a tubulação acima descrita, Figura 1).
Este protocolo baseado em fluorescência BODIPY 493/503 para avaliação de DL teve como objetivo desenvolver uma nova abordagem de imagem para a avaliação da esteatose hepática. Dada a forte correlação entre obesidade e doença hepática gordurosa, a dieta hiperlipídica de estilo ocidental foi utilizada para estabelecer um modelo animal de esteatose hepática26. Um aumento robusto no conteúdo hepático de TG foi confirmado por um kit de ensaio colorimétrico quantitativo de triglicerídeos.......
Esta investigação foi financiada por fundos nacionais e europeus através da Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) e Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE): 2020.09481.BD, UIDP/04539/2020 (CIBB) e POCI-01-0145-FEDER-007440. Os autores agradecem o apoio do iLAB - Laboratório de Microscopia e Bioimagem, unidade da Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra e membro da infraestrutura nacional PPBI-Plataforma Portuguesa de BioImagem (POCI-01-0145-FEDER-022122), bem como o apoio do FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set | Fisher Scientific | ||
4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | D3922 | |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR | D1306 | |
70% ethanol | Honeywell | 10191455 | |
Adobe Illustrator CC | Adobe Inc. | Used to design the figures | |
Automatic analyzer Hitachi 717 | Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany | 8177-30-0010 | |
Barrier pen (Liquid blocker super pap pen) | Daido Sangyo Co., Ltd, Japon | _ | |
Blade | Leica | 221052145 | Used in the cryostat |
Cell Profiler version 4.2.5 | https://cellprofiler.org/releases/ | Used to analyse the acquired images | |
Coverslips | Menzel-Glaser, Germany | _ | |
Cryomolds | Tissue-Tek | _ | |
Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S | Leica Biosystems | _ | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | D-8418 | Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles. |
Dry ice container (styrofoam cooler) | Novolab | A26742 | |
Dumont forceps | Fine Science Tools, Germany | 11295-10 | |
Glass Petri dish (H 25 mm, ø 150 mm) | Thermo Scientific | 150318 | Used to weigh the liver after dissection |
Glycergel | DAKO Omnis | S303023 | |
GraphPad Prism software, version 9.3.1 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA | ||
High-fat diet | Envigo, Barcelona, Spain | MD.08811 | |
Ketamine (Nimatek 100 mg/mL) | Dechra | 791/01/14DFVPT | Used at a final concentration of 75 mg/kg |
Laser scanning confocal microscope (QUASAR detection unit; ) | Carl Zeiss, germany | LSM 710 Axio Observer Z1 microscope | |
Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Dechra | 1838 ESP / 020/01/07RFVPT | Used at a final concentration of 1 mg/kg |
Needle | BD microlance | 300635 | |
No 15 Sterile carbon steel scalpel Blade | Swann-Morton | 205 | |
Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil) | Carl Zeiss, Germany | ||
Paint brushes | Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X | Used to handle cryosections | |
Peristaltic pump (Minipuls 3) | Gilson | 1004170 | |
Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | P3813 | |
Scalpel handle, 125 mm (5"), No. 3 | Swann-Morton | 0208 | |
Slide staining system StainTray | Simport Scientific | M920 | |
Standard diet | Mucedola | 4RF21 | |
Superfrost Plus microscope slides | Menzel-Glaser, Germany | J1800AMNZ | |
Tissue-Tek OCT mounting media | VWR CHEMICALS | 361603E | |
Triglycerides colorimetric assay kit | Cayman Chemical | 10010303 | |
Ultrasonic bath | Bandelin Sonorex | TK 52 | |
Vannas spring scissors - 3 mm cutting edge | Fine Science Tools, Germany | 15000-00 | |
ZEN Black software | Zeiss |
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