بروتوكول فعال لتحليل CUT&RUN لخلايا الأقمار الصناعية للفأر المعزولة FACS

Summary

يظهر هنا بروتوكول فعال لعزل فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) للخلايا الساتلية لعضلات أطراف الفأر التي تم تكييفها لدراسة تنظيم النسخ في ألياف العضلات عن طريق الانقسام تحت الأهداف وإطلاقها باستخدام النيوكلياز (CUT &RUN).

Abstract

تشكل التحليلات على مستوى الجينوم مع مجموعات الخلايا الصغيرة عائقا رئيسيا للدراسات ، لا سيما في مجال الخلايا الجذعية. يصف هذا العمل بروتوكولا فعالا لعزل فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) للخلايا الساتلية من عضلة الأطراف ، وهي نسيج يحتوي على نسبة عالية من البروتينات الهيكلية. تم تعطيل عضلات الأطراف المشرحة من الفئران البالغة ميكانيكيا عن طريق الفرم في وسط مكمل بالكولاجين من النوع الأول. عند الهضم ، تم ترشيح التجانس من خلال مصافي الخلايا ، وتم تعليق الخلايا في المخزن المؤقت FACS. تم تحديد الصلاحية مع صبغة قابلة للتثبيت ، وتم عزل الخلايا الساتلية الملطخة بالمناعة بواسطة FACS. تم تحليل الخلايا باستخدام Triton X-100 وكانت النوى المنبعثة مرتبطة بخرز كونكانافالين أ المغناطيسي. تم تحضين معقدات النواة / الخرز بأجسام مضادة ضد عامل النسخ أو تعديلات الهستون ذات الأهمية. بعد الغسلات ، تم تحضين معقدات النواة / الخرز ببروتين A-micrococcal nuclease ، وبدأ انقسام الكروماتين باستخدام CaCl₂. بعد استخراج الحمض النووي ، تم إنشاء المكتبات وتسلسلها ، وتم الحصول على ملفات تعريف ارتباط عامل النسخ على مستوى الجينوم وتعديلات الهستون التساهمي عن طريق التحليل المعلوماتي الحيوي. أظهرت القمم التي تم الحصول عليها لمختلف علامات الهستون أن أحداث الارتباط كانت خاصة بالخلايا الساتلية. علاوة على ذلك ، كشف تحليل الزخارف المعروف أن عامل النسخ كان مرتبطا بالكروماتين عبر عنصر الاستجابة المماثل. لذلك تم تكييف هذا البروتوكول لدراسة التنظيم الجيني في الخلايا الساتلية لعضلات أطراف الفئران البالغة.

Introduction

تمثل العضلات المخططة الهيكلية في المتوسط 40٪ من وزن إجمالي جسم الإنسان¹. تظهر ألياف العضلات قدرة ملحوظة على التجدد عند الإصابة ، والتي توصف باندماج الخلايا العضلية المشكلة حديثا وتوليد ألياف عضلية جديدة تحل محل الخلايا التالفة². في عام 1961 ، أبلغ ألكسندر ماورو عن مجموعة من الخلايا أحادية النواة التي أطلق عليها اسم خلايا الأقمار الصناعية³. تعبر هذه الخلايا الجذعية عن عامل النسخ المقترن بالمربع 7 (PAX7) ، وتقع بين الصفيحة القاعدية وساركوليما الألياف العضلية⁴. تم الإبلاغ عن أنها تعبر عن مجموعة التمايز 34 (CD34 ؛ علامة الخلايا الجذعية المكونة للدم ، البطانية ، وعلامة الخلايا ا....

Protocol

تم الاحتفاظ بالفئران في بيت معتمد ، وفقا للمبادئ التوجيهية الوطنية لرعاية (توجيه المفوضية الأوروبية 86/609 / CEE; المرسوم الفرنسي رقم 87-848) بشأن استخدام المختبر للبحث. تم تقديم التلاعبات المقصودة إلى اللجنة الأخلاقية (Com'Eth ، ستراسبورغ ، فرنسا) وإلى وزارة الأبحاث الفرنسية (MESR) للتقييم الأخلاقي وا.......

Discussion

تشير الدراسة الحالية إلى طريقة موحدة وموثوقة وسهلة الأداء لعزل وثقافة خلايا الأقمار الصناعية للفأر ، بالإضافة إلى تقييم تنظيم النسخ بواسطة طريقة CUT &RUN.

يتضمن هذا البروتوكول عدة خطوات حاسمة. الأول هو اضطراب العضلات وهضم الألياف لضمان وجود عدد كبير من الخلايا المجمعة. على ال?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microtube	Eppendorf	2080422
2 mL microtube	Star Lab	S1620-2700
5 mL tubes	CORNING-FALCON	352063
50 mL tubes	Falcon	352098
anti-AR	abcam	ab108341
anti-CD11b	eBioscience	25-0112-82
anti-CD31	eBioscience	12-0311-82
anti-CD34	eBioscience	48-0341-82
anti-CD45	eBioscience	12-0451-83
anti-CXCR4	eBioscience	17-9991-82
anti-DMD	abcam	ab15277
anti-H3K27ac	Active Motif	39133
anti-H3K4me2	Active Motif	39141
anti-ITGA7	MBL	k0046-4
anti-PAX7	DSHB	AB_528428
anti-TER119	BD Pharmingen TM	553673
Beads	Polysciences	86057-3	BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µm	Corning®	431752
Cell Strainer 40 µm	Corning®	431750
Cell Strainer 70 µm	Corning®	431751
Centrifuge 1	Eppendorf	521-0011	Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2	Eppendorf	5805000010	Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System	ThermoFischer	171080	Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agent	Sigma	SLBQ7780V	RNaseZAPTM
Collagenase, type I	Thermo Fisher	17100017	10 mg/mL
Dispase	STEMCELL technologies	7913	5 U/mL
DynaMag™-2 Aimant	Invitrogen	12321D
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	565388
Flow cytometer	BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer	23-14816-01
Fluoromount G with DAPI	Invitrogen	00-4959-52
Genome browser	IGV		http://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Hydrogel	Corning®	354277	Matrigel hESC qualified matrix
Image processing software	Image J®		V 1.8.0
Laboratory film	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	PARAFILM® M
Liberase LT	Roche	5401020001
Propyl gallate	Sigma-Aldrich	2370
Sequencer	Illumina Hiseq 4000	SY-401-4001
Shaking water bath	Bioblock Scientific polytest 20	18724