En effektiv protokol til CUT&RUN-analyse af FACS-isolerede musesatellitceller

Genomdækkende analyser med små cellepopulationer er en væsentlig begrænsning for undersøgelser, især inden for stamcelleområdet. Dette arbejde beskriver en effektiv protokol til fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) isolering af satellitceller fra lemmernes muskel, et væv med et højt indhold af strukturelle proteiner. Dissekerede lemmer muskler fra voksne mus blev mekanisk forstyrret ved hakning i medium suppleret med dispase og type I collagenase. Efter fordøjelsen blev homogenatet filtreret gennem cellefiltre, og celler blev suspenderet i FACS-buffer. Levedygtighed blev bestemt med fikserbar levedygtighedsplet, og immunfarvede satellitceller blev isoleret af FACS. Celler blev lyseret med Triton X-100 og frigivne kerner blev bundet til concanavalin A magnetiske perler. Kerne-/perlekomplekser blev inkuberet med antistoffer mod transkriptionsfaktoren eller histonmodifikationer af interesse. Efter vask blev kerne-/perlekomplekser inkuberet med protein A-mikrokoknukylase, og kromatinspaltning blev initieret med CaCl2_. Efter DNA-ekstraktion blev biblioteker genereret og sekventeret, og profilerne for genom-wide transkriptionsfaktorbinding og kovalente histonmodifikationer blev opnået ved bioinformatisk analyse. Toppene opnået for de forskellige histonmærker viste, at bindingsbegivenhederne var specifikke for satellitceller. Desuden afslørede kendt motivanalyse, at transkriptionsfaktoren var bundet til kromatin via dets beslægtede responselement. Denne protokol er derfor tilpasset til at studere genregulering i voksne mus lemmer muskel satellitceller.