En effektiv protokol til CUT&RUN-analyse af FACS-isolerede musesatellitceller

Summary

Præsenteret her er en effektiv protokol til fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) isolering af muskelsatellitceller i muselemmer tilpasset undersøgelsen af transkriptionsregulering i muskelfibre ved spaltning under mål og frigivelse ved hjælp af nuklease (CUT &RUN).

Abstract

Genomdækkende analyser med små cellepopulationer er en væsentlig begrænsning for undersøgelser, især inden for stamcelleområdet. Dette arbejde beskriver en effektiv protokol til fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) isolering af satellitceller fra lemmernes muskel, et væv med et højt indhold af strukturelle proteiner. Dissekerede lemmer muskler fra voksne mus blev mekanisk forstyrret ved hakning i medium suppleret med dispase og type I collagenase. Efter fordøjelsen blev homogenatet filtreret gennem cellefiltre, og celler blev suspenderet i FACS-buffer. Levedygtighed blev bestemt med fikserbar levedygtighedsplet, og immunfarvede satellitceller blev isoleret af FACS. Celler blev lyseret med Triton X-100 og frigivne kerner blev bundet til concanavalin A magnetiske perler. Kerne-/perlekomplekser blev inkuberet med antistoffer mod transkriptionsfaktoren eller histonmodifikationer af interesse. Efter vask blev kerne-/perlekomplekser inkuberet med protein A-mikrokoknukylase, og kromatinspaltning blev initieret med CaCl2_. Efter DNA-ekstraktion blev biblioteker genereret og sekventeret, og profilerne for genom-wide transkriptionsfaktorbinding og kovalente histonmodifikationer blev opnået ved bioinformatisk analyse. Toppene opnået for de forskellige histonmærker viste, at bindingsbegivenhederne var specifikke for satellitceller. Desuden afslørede kendt motivanalyse, at transkriptionsfaktoren var bundet til kromatin via dets beslægtede responselement. Denne protokol er derfor tilpasset til at studere genregulering i voksne mus lemmer muskel satellitceller.

Introduction

Skeletstribede muskler udgør i gennemsnit 40% af vægten af den samlede menneskelige krop¹. Muskelfibre udviser en bemærkelsesværdig evne til regenerering ved skade, hvilket beskrives ved fusion af nydannede myocytter og generering af nye myofibre, der erstatter de beskadigede². I 1961 rapporterede Alexander Mauro en population af mononukleære celler, som han betegnede som satellitceller³. Disse stamceller udtrykker transkriptionsfaktoren parret boks 7 (PAX7) og er placeret mellem basal lamina og sarcolemma af muskelfibre⁴. De blev rapporteret at udtrykke klyngen af differen....

Protocol

Mus blev holdt i et akkrediteret dyrehus i overensstemmelse med National Animal Care Guidelines (Europa-Kommissionens direktiv 86/609/CEE; Fransk dekret nr. 87-848) om anvendelse af forsøgsdyr til forskning. Tilsigtede manipulationer blev forelagt det etiske udvalg (Com'Eth, Strasbourg, Frankrig) og det franske forskningsministerium (MESR) til etisk evaluering og godkendelse i henhold til 2010/63/EU-direktivet under APAFIS-nummer #22281.

1. Fremstilling af cellesuspension til isolering .......

Discussion

Denne undersøgelse rapporterer en standardiseret, pålidelig og let at udføre metode til isolering og dyrkning af musesatellitceller samt vurdering af transkriptionsregulering ved hjælp af CUT &RUN-metoden.

Denne protokol involverer flere kritiske trin. Den første er muskelforstyrrelser og fiberfordøjelse for at sikre et stort antal indsamlede celler. På trods af den øgede enzymkoncentration blev der opnået flere levende celler end ved anvendelse af protokol 1. Satellitceller udtrykker.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microtube	Eppendorf	2080422
2 mL microtube	Star Lab	S1620-2700
5 mL tubes	CORNING-FALCON	352063
50 mL tubes	Falcon	352098
anti-AR	abcam	ab108341
anti-CD11b	eBioscience	25-0112-82
anti-CD31	eBioscience	12-0311-82
anti-CD34	eBioscience	48-0341-82
anti-CD45	eBioscience	12-0451-83
anti-CXCR4	eBioscience	17-9991-82
anti-DMD	abcam	ab15277
anti-H3K27ac	Active Motif	39133
anti-H3K4me2	Active Motif	39141
anti-ITGA7	MBL	k0046-4
anti-PAX7	DSHB	AB_528428
anti-TER119	BD Pharmingen TM	553673
Beads	Polysciences	86057-3	BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µm	Corning®	431752
Cell Strainer 40 µm	Corning®	431750
Cell Strainer 70 µm	Corning®	431751
Centrifuge 1	Eppendorf	521-0011	Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2	Eppendorf	5805000010	Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System	ThermoFischer	171080	Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agent	Sigma	SLBQ7780V	RNaseZAPTM
Collagenase, type I	Thermo Fisher	17100017	10 mg/mL
Dispase	STEMCELL technologies	7913	5 U/mL
DynaMag™-2 Aimant	Invitrogen	12321D
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	565388
Flow cytometer	BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer	23-14816-01
Fluoromount G with DAPI	Invitrogen	00-4959-52
Genome browser	IGV		http://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Hydrogel	Corning®	354277	Matrigel hESC qualified matrix
Image processing software	Image J®		V 1.8.0
Laboratory film	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	PARAFILM® M
Liberase LT	Roche	5401020001
Propyl gallate	Sigma-Aldrich	2370
Sequencer	Illumina Hiseq 4000	SY-401-4001
Shaking water bath	Bioblock Scientific polytest 20	18724