Een efficiënt protocol voor CUT&RUN-analyse van FACS-geïsoleerde muissatellietcellen

Summary

Hier wordt een efficiënt protocol gepresenteerd voor de fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) isolatie van spiersatellietcellen van muizenledematen, aangepast aan de studie van transcriptieregulatie in spiervezels door splitsing onder doelen en afgifte met behulp van nuclease (CUT&RUN).

Abstract

Genoomwijde analyses met kleincellige populaties zijn een belangrijke beperking voor studies, met name op het gebied van stamcellen. Dit werk beschrijft een efficiënt protocol voor de fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) isolatie van satellietcellen uit de ledemaatspier, een weefsel met een hoog gehalte aan structurele eiwitten. Ontlede ledemaatspieren van volwassen muizen werden mechanisch verstoord door fijnhakken in medium aangevuld met dispase en type I collagenase. Na de spijsvertering werd het homogenaat gefilterd door celzeven en werden de cellen gesuspendeerd in de FACS-buffer. De levensvatbaarheid werd bepaald met een fixeerbare levensvatbaarheidskleuring en immunogekleurde satellietcellen werden geïsoleerd door FACS. Cellen werden gelyseerd met Triton X-100 en vrijgekomen kernen werden gebonden aan concanavalin A magnetische kralen. Kern/kraalcomplexen werden geïncubeerd met antilichamen tegen de transcriptiefactor of histonmodificaties van belang. Na wasbeurten werden kern/kraalcomplexen geïncubeerd met proteïne A-microkokkennuclease en werd chromatinesplitsing geïnitieerd met CaCl₂. Na DNA-extractie werden bibliotheken gegenereerd en gesequenced, en de profielen voor genoombrede transcriptiefactorbinding en covalente histonmodificaties werden verkregen door bio-informatica-analyse. De pieken die voor de verschillende histonmarkeringen werden verkregen, toonden aan dat de bindingsgebeurtenissen specifiek waren voor satellietcellen. Bovendien onthulde bekende motiefanalyse dat de transcriptiefactor gebonden was aan chromatine via het verwante responselement. Dit protocol is daarom aangepast om genregulatie te bestuderen in spiercellen van volwassen muizen.

Introduction

Dwarsgestreepte skeletspieren vertegenwoordigen gemiddeld 40% van het gewicht van het totale menselijk lichaam¹. Spiervezels vertonen een opmerkelijk vermogen tot regeneratie bij letsel, wat wordt beschreven door de fusie van nieuw gevormde myocyten en de aanmaak van nieuwe myovezels die de beschadigde vervangen². In 1961 rapporteerde Alexander Mauro een populatie van mononucleaire cellen die hij satellietcellen³ noemde. Deze stamcellen brengen de transcriptiefactor gepaarde box 7 (PAX7) tot expressie en bevinden zich tussen de basale lamina en het sarcolemma van spiervezels⁴

Protocol

Muizen werden gehouden in een erkende stal, in overeenstemming met de National Animal Care Guidelines (richtlijn 86/609/EEG van de Europese Commissie; Frans decreet nr. 87-848) over het gebruik van proefdieren voor onderzoek. Voorgenomen manipulaties werden voorgelegd aan de ethische commissie (Com'Eth, Straatsburg, Frankrijk) en aan het Franse ministerie van Onderzoek (MESR) voor ethische evaluatie en autorisatie volgens de richtlijn 2010/63/EU onder het APAFIS-nummer #22281.

1. Bereidi.......

Discussion

De huidige studie rapporteert een gestandaardiseerde, betrouwbare en eenvoudig uit te voeren methode voor de isolatie en kweek van muissatellietcellen, evenals de beoordeling van transcriptionele regulatie door de CUT&RUN-methode.

Dit protocol omvat verschillende kritieke stappen. De eerste is spierverstoring en vezelvertering om een groot aantal verzamelde cellen te garanderen. Ondanks de verhoogde enzymconcentratie werden er meer levende cellen verkregen dan bij gebruik van Protocol 1. Satel.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microtube	Eppendorf	2080422
2 mL microtube	Star Lab	S1620-2700
5 mL tubes	CORNING-FALCON	352063
50 mL tubes	Falcon	352098
anti-AR	abcam	ab108341
anti-CD11b	eBioscience	25-0112-82
anti-CD31	eBioscience	12-0311-82
anti-CD34	eBioscience	48-0341-82
anti-CD45	eBioscience	12-0451-83
anti-CXCR4	eBioscience	17-9991-82
anti-DMD	abcam	ab15277
anti-H3K27ac	Active Motif	39133
anti-H3K4me2	Active Motif	39141
anti-ITGA7	MBL	k0046-4
anti-PAX7	DSHB	AB_528428
anti-TER119	BD Pharmingen TM	553673
Beads	Polysciences	86057-3	BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µm	Corning®	431752
Cell Strainer 40 µm	Corning®	431750
Cell Strainer 70 µm	Corning®	431751
Centrifuge 1	Eppendorf	521-0011	Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2	Eppendorf	5805000010	Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System	ThermoFischer	171080	Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agent	Sigma	SLBQ7780V	RNaseZAPTM
Collagenase, type I	Thermo Fisher	17100017	10 mg/mL
Dispase	STEMCELL technologies	7913	5 U/mL
DynaMag™-2 Aimant	Invitrogen	12321D
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	565388
Flow cytometer	BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer	23-14816-01
Fluoromount G with DAPI	Invitrogen	00-4959-52
Genome browser	IGV		http://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Hydrogel	Corning®	354277	Matrigel hESC qualified matrix
Image processing software	Image J®		V 1.8.0
Laboratory film	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	PARAFILM® M
Liberase LT	Roche	5401020001
Propyl gallate	Sigma-Aldrich	2370
Sequencer	Illumina Hiseq 4000	SY-401-4001
Shaking water bath	Bioblock Scientific polytest 20	18724