Un protocole efficace pour l’analyse CUT&RUN de cellules satellites de souris isolées par FACS

Résumé

Un protocole efficace pour le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) est présenté ici des cellules satellites musculaires des membres de souris, adapté à l’étude de la régulation de la transcription dans les fibres musculaires par clivage sous cibles et libération par nucléase (CUT&RUN).

Résumé

Les analyses à l’échelle du génome avec des populations de petites cellules constituent une contrainte majeure pour les études, en particulier dans le domaine des cellules souches. Ce travail décrit un protocole efficace pour l’isolement des cellules satellites du muscle du membre, un tissu à haute teneur en protéines structurelles. Les muscles des membres disséqués de souris adultes ont été perturbés mécaniquement par hachage dans un milieu complété par de la dispase et de la collagénase de type I. Lors de la digestion, l’homogénat a été filtré à travers des tamis cellulaires et les cellules ont été mises en suspension dans un tampon FACS. La viabilité a été déterminée à l’aide d’une coloration de viabilité réparable, et les cellules satellites immunocolorées ont été isolées par FACS. Les cellules ont été lysées avec Triton X-100 et les noyaux libérés ont été liés à des billes magnétiques de concanavaline A. Des complexes noyau/billes ont été incubés avec des anticorps contre le facteur de transcription ou les modifications d’histones d’intérêt. Après les lavages, les complexes noyau/billes ont été incubés avec la protéine A-micrococcique nucléase, et le clivage de la chromatine a été initié avec CaCl₂. Après l’extraction de l’ADN, des banques ont été générées et séquencées, et les profils de liaison aux facteurs de transcription à l’échelle du génome et de modifications des histones covalentes ont été obtenus par analyse bioinformatique. Les pics obtenus pour les différentes marques d’histones ont montré que les événements de liaison étaient spécifiques aux cellules satellites. De plus, l’analyse des motifs connus a révélé que le facteur de transcription était lié à la chromatine via son élément de réponse apparenté. Ce protocole est donc adapté pour étudier la régulation des gènes dans les cellules satellites musculaires des membres de souris adultes.

Introduction

Les muscles striés squelettiques représentent en moyenne 40 % du poids de l’ensemble du corps humain¹. Les fibres musculaires présentent une capacité remarquable de régénération en cas de blessure, qui est décrite par la fusion des myocytes nouvellement formés et la génération de nouvelles myofibres qui remplacent celles endommagées². En 1961, Alexander Mauro a signalé une population de cellules mononucléées qu’il a appelées cellules satellites³. Ces cellules souches expriment le facteur de transcription apparié boîte 7 (PAX7), et sont situées entre la lame basale et le sarcolemme des fibres musculaires⁴. Il a été rapporté qu’ils exprimaient le cluster de différenciation 34 (CD34 ; un marqueur hématopoïétique, progéniteur endothélial et marqueur de cellules souches mésenchymateuses), l’intégrine alpha 7 (ITGA7 ; un marqueur de muscles lisses, cardiaques et squelettiques), ainsi que le récepteur de chimiokines C-X-C de type 4 (CXCR4 ; un marqueur lymphocytaire, hématopoïétique et de cellules satellites)⁵. Dans des conditions basales, les cellules satellites résident dans un microenvironnement particulier qui les maintient dans un état de repos⁶. Lors d’une lésion musculaire, ils s’activent, prolifèrent et subissent une myogenèse⁷. Cependant, ne contribuant qu’à une fraction mineure du nombre total de cellules musculaires, leurs analyses à l’échelle du génome sont particulièrement difficiles, en particulier dans des contextes physiologiques (<1% du nombre total de cellules).

Diverses méthodes d’isolement de la chromatine à partir de cellules satellites ont été décrites, qui impliquent l’immunoprécipitation de la chromatine suivie d’expériences de séquençage parallèle massif (ChIP-seq) ou de clivage sous cibles et marquage (CUT&Tag). Néanmoins, ces deux techniques présentent des limites importantes qui restent incontestées. En effet, le ChIP-seq nécessite une grande quantité de matière première pour générer suffisamment de chromatine, dont une grande partie est perdue lors de l’étape de sonication. CUT&Tag est plus approprié pour un faible nombre de cellules, mais génère plus de sites de clivage hors cible que ChIP-seq en raison de l’activité de la transposase Tn5. De plus, étant donné que cette enzyme a une forte affinité pour les régions ouvertes de la chromatine, l’approche CUT&Tag pourrait être utilisée préférentiellement pour analyser les modifications des histones ou les facteurs de transcription associés à des régions du génome activement transcrites, au lieu de l’hétérochromatine réduite au silence ^8,9.

Nous présentons ici un protocole détaillé qui permet l’isolement des cellules satellites musculaires des membres de souris par FACS pour le clivage sous les cibles et la libération à l’aide de l’analyse de nucléase (CUT&RUN)^10,11. Les différentes étapes impliquent la perturbation mécanique des tissus, le tri cellulaire et l’isolement des noyaux. L’efficacité de la méthode, en ce qui concerne la préparation d’une suspension cellulaire viable, a été démontrée par la réalisation d’une analyse CUT&RUN pour les modifications covalentes des histones et les facteurs de transcription. La qualité des cellules isolées rend la méthode décrite particulièrement intéressante pour la préparation de la chromatine qui capture fidèlement l’état d’occupation génomique natif, et est susceptible d’être adaptée pour capturer la conformation chromosomique en combinaison avec le séquençage à haut débit à des loci spécifiques (4C-seq) ou à des niveaux à l’échelle du génome (Hi-C).

Protocole

Les souris ont été gardées dans un bâtiment d’élevage accrédité, conformément aux directives nationales en matière de soins aux animaux (directive 86/609/CEE de la Commission européenne ; Décret n°87-848) relatif à l’utilisation d’animaux de laboratoire pour la recherche. Les manipulations envisagées ont été soumises au comité d’éthique (Com’Eth, Strasbourg, France) et au Ministère de la Recherche (MESR) pour évaluation éthique et autorisation conformément à la directive 2010/63/UE sous le numéro APAFIS #22281.

1. Préparation d’une suspension cellulaire pour l’isolement de cellules satellites par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) (Figure 1)

1. Isolement du tissu musculaire
   1. Décontaminer les outils de dissection musculaire, y compris les forceps, les scalpels et les ciseaux, à l’aide d’un produit de nettoyage (tableau 1), et rincer abondamment à l’eau distillée.
   2. Préparez deux tubes de 2 mL (tableau 1), contenant chacun 1 mL de tampon d’isolation musculaire, et placez-les sur de la glace pour recueillir les muscles prélevés.
   3. Sacrifier deux souris mâles C57/Bl6J âgées de 10 semaines par asphyxie au CO₂ suivie d’une luxation cervicale. Vaporisez de l’éthanol à 70 % sur chaque souris entière. Décollez la peau du membre postérieur à l’aide d’une pince. Disséquez tous les muscles des membres entourant le fémur, le tibia et le péroné (environ 1 mg de muscles par souris).
      REMARQUE : Le nombre de cellules satellites diminue après l’âge de 15 semaines.
   4. Placer les muscles des membres prélevés dans des tubes de 2 mL contenant 1 mL de tampon d’isolement musculaire préparé à l’étape 1.1.2. Collectez les muscles de la deuxième souris en suivant la même procédure. Hacher les muscles récoltés avec des ciseaux sur de la glace jusqu’à l’obtention de³ fragments inférieurs à 1 mm.
      REMARQUE : Les muscles ont été prélevés et hachés principalement comme décrit¹². Effectuez la digestion des tissus en suivant l’étape 1.2 ou 1.3.
2. Digestion des tissus avec l’enzyme collagénase
   1. Transférez la suspension musculaire hachée des deux souris en la versant dans un tube de 50 mL (tableau 1) contenant 18 mL de tampon d’isolement musculaire (complété par 5 mL [5 U/mL] de dispase et 5 mg de collagénase de type I) (tableau 1).
   2. Fermez hermétiquement le tube et scellez-le avec un film de laboratoire (tableau 1). Placez-le horizontalement dans un bain-marie agité (tableau 1) à 37 °C à 100 tr/min pendant 30 min.
   3. Après 30 min, ajoutez 5 mg de collagénase de type I. Maintenir les tubes encore 30 minutes sous agitation dans un bain-marie à agitation à 37 °C à 100 tr/min.
   4. Lors de la digestion, pipetez la suspension musculaire de haut en bas 10 fois avec une pipette de 10 ml pour améliorer l’efficacité de la dissociation. Centrifuger à 4 °C à 400 x g pendant 5 min. Une pastille transparente sera visible au fond du tube. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette de 10 mL, en laissant 5 mL de milieu dans le tube.
      REMARQUE : Quitter le milieu permet d’éviter de stresser les cellules. Ajouter 10 mL de tampon d’isolation musculaire frais et remettre la pastille en suspension en pipetant de haut en bas avec une pipette de 10 mL.
   5. Placer des crépines de 100 μm, 70 μm et 40 μm (une de chaque type) (tableau 1) sur des tubes ouverts de 50 ml. Pipeter la suspension sur les crépines successives (100 μm, 70 μm, 40 μm) et recueillir l’écoulement dans les tubes de 50 mL, contenant des cellules inférieures à 40 μm.
   6. Centrifuger la suspension à 4 °C à 400 x g pendant 5 min. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette de 10 mL jusqu’à ce qu’il reste 2 mL, puis utiliser une pipette de 0,2 à 1 mL jusqu’à ce qu’il reste 100 à 200 μL. Remettre la pastille en suspension dans 2 mL de tampon de lyse des globules rouges (tableau 2). Incuber sur glace pendant 3 min.
   7. Centrifuger à 4 °C à 400 x g pendant 5 min et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette de 20 à 200 μL. Remettre les cellules en suspension dans 100 μL de tampon FACS froid (tableau 2). Déposer sur de la glace.
3. Méthode alternative pour la digestion des tissus avec l’enzyme Liberase thermolysine low (TL)
   1. Suivez les descriptions de l’étape 1.1. pour l’isolement des tissus.
   2. Pour la désagrégation tissulaire médiée par la Liberase, prélever les muscles dans 2 mL de tampon d’isolement du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (tableau 2), au lieu du tampon d’isolement musculaire décrit à l’étape 1.1.2.
   3. Transférez la suspension musculaire hachée des deux souris en la versant dans un tube de 50 mL (tableau 1) contenant 18 mL de tampon d’isolement RPMI complété par 300 ou 600 μL de Liberase TL à 5 mg/mL (tableau 1) (c.-à-d. 0,083 mg/mL et 0,167 mg/mL de concentrations finales, respectivement)¹³.
   4. Fermez hermétiquement le tube et scellez-le avec un film de laboratoire (tableau 1). Placez-le horizontalement dans un bain-marie agité (tableau 1) à 37 °C à 100 tr/min pendant 30 min.
   5. Lors de la digestion, pipetez la suspension musculaire de haut en bas 10 fois avec une pipette de 10 ml pour la dissocier et améliorer l’efficacité de la dissociation.
   6. Centrifuger à 4 °C à 400 x g pendant 5 min. Une pastille transparente sera visible au fond du tube. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette de 10 mL, en laissant 5 mL de milieu dans le tube. Quitter le milieu permet d’éviter de stresser les cellules. Ajouter 10 mL de tampon d’isolement RPMI frais et remettre la pastille en suspension en pipetant de haut en bas à l’aide d’une pipette de 10 mL.
   7. Placer des crépines de 100 μm, 70 μm et 40 μm (une de chaque type) (tableau 1) sur des tubes ouverts de 50 ml.
   8. Pipeter la suspension sur des crépines successives (100 μm, 70 μm, 40 μm) et recueillir l’écoulement dans les tubes de 50 mL, contenant des cellules inférieures à 40 μm.
   9. Centrifuger la suspension à 4 °C à 400 x g pendant 5 min. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette de 10 mL jusqu’à ce qu’il reste 2 mL, puis utiliser une pipette de 0,2 à 1 mL jusqu’à ce qu’il reste 100 à 200 μL.
   10. Remettre la pastille en suspension dans 2 mL de tampon de lyse des globules rouges (tableau 2). Incuber sur glace pendant 3 min.
   11. Centrifuger à 4 °C à 400 x g pendant 5 min et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette de 20 à 200 μL.
   12. Remettre les cellules en suspension dans 100 μL de tampon FACS froid (tableau 2). Déposer sur de la glace.
4. Préparation de la suspension cellulaire pour l’isolement du FACS
   1. Transférer 10 μL de la suspension cellulaire obtenue à l’étape 1.2.12 dans un tube neuf de 1,5 mL. Cet échantillon constituera le témoin non coloré ou le témoin négatif (figure 2). Ajouter 190 μL de tampon FACS, transférer dans un tube de 5 mL (tableau 1) et conserver sur de la glace.
   2. Centrifuger les 90 μL restants de la suspension cellulaire obtenue à l’étape 1.2.12 à 4 °C à 400 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant à l’aide d’une pipette (volume de pointe de 20 à 200 μL). Incuber les cellules avec 400 μL de colorant de viabilité fixable (tableau 3) dilué dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) sans sérum pendant 15 minutes à température ambiante (RT).
   3. Laver les cellules par centrifugation à 4 °C à 400 x g pendant 5 min et ajouter 100 μL de tampon FACS. Retournez doucement les tubes trois fois et centrifugez à nouveau à 4 °C à 400 x g pendant 5 min.
   4. Pendant le temps de centrifugation, préparer 100 μL d’un mélange maître d’anticorps primaires couplés à des fluorophores et dirigés contre CD11b, CD31, CD45, TER119, CD34, ITGA7 et CXCR4 (tableau 3), dilués dans un tampon FACS.
   5. Centrifuger à 400 x g pendant 5 min à 4 °C, jeter le surnageant cellulaire à l’aide d’une pipette (volume de pointe de 20 à 200 μL) et ajouter le mélange d’anticorps de 100 μL. Retournez doucement le tube trois fois. Ne pas vortex. Incuber dans l’obscurité sur de la glace pendant 30 min.
   6. Centrifuger à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Éliminez le surnageant à l’aide d’une pipette de 20 à 200 μL et ajoutez 500 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1x pour laver les cellules. Retournez doucement le tube trois fois. Recentrer à 400 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette de 20 à 200 μL.
   7. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 500 μL de tampon FACS et transférer la suspension dans un tube de 5 mL.
      REMARQUE : la suspension cellulaire obtenue à partir de la digestion de Liberase est traitée de la même manière.
5. Sélection des cellules satellites par FACS
   1. Faire vortex brièvement la suspension cellulaire (2 à 5 secondes) et traiter les cellules sur un cytomètre en flux équipé d’une buse de 100 μm (Tableau 1).
   2. Déterminer les différentes tailles de porte en fonction de l’échantillon non coloré stocké à l’étape 1.4.1 (Figure 2).
   3. Enduisez un tube de 5 ml de 1 mL de sérum fœtal pur pour veau (FCS) pour améliorer la collecte de cellules et ajoutez 500 μL de tampon FACS.
   4. Remplacez l’échantillon non coloré par l’échantillon marqué par des anticorps.
   5. Sélectionnez la population d’intérêt en fonction de la zone de diffusion vers l’avant (FSC-A) et de la zone de diffusion latérale (SSC-A) (Figure 3A), et supprimez les cellules de doublet avec le FSC-A et la hauteur de diffusion vers l’avant (FSC-H) (Figure 3B)¹⁴.
   6. Identifier les cellules vivantes présentant une coloration négative à la viabilité réparable (Figure 3C).
   7. Sélectionnez les cellules négatives pour CD31, CD45, TER119 et CD11b (Figure 3D).
   8. Pour identifier les cellules satellites, sélectionnez d’abord les cellules positives pour CD34 et ITGA7 (Figure 3E), puis sélectionnez les cellules CXCR4 positives sur la population sélectionnée pour CD34 et ITGA7 (Figure 3F).
   9. Prélever les cellules sélectionnées (entre 40 000 et 80 000 cellules, selon la qualité de la préparation) dans le tube enrobé de 5 mL contenant 500 μL de tampon FACS.

2. Validation de la population isolée en culture tissulaire

1. Revêtement de lame avec hydrogel
   1. Diluer 280 μL d’une matrice qualifiée pour les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) à base d’hydrogel pur (tableau 1) dans 12 mL de milieu DMEM/F12 sans sérum.
   2. Enduisez une lame de chambre (tableau 1) avec la solution d’hydrogel et incubez-la toute la nuit à 4 °C.
   3. Le lendemain, incuber la lame de chambre à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 1 h avant l’ensemencement des cellules.
2. Croissance et différenciation cellulaires
   1. Plaquer environ 20 000 cellules, obtenues à partir de l’étape 1.5.9, par puits, et les cultiver dans un milieu de culture (tableau 2) pendant 5 jours. Prendre des images à contraste de phase à l’aide d’un microscope à fond clair (Figure 4A), avant de les traiter pour l’analyse par immunofluorescence afin de s’assurer de la qualité de la préparation (Figure 4B).
   2. Pour induire la myogenèse, cultiver des cellules satellites amplifiées à partir de l’étape 2.2.1 dans un milieu myogénique (tableau 2) pendant 7 jours supplémentaires. Prendre des images à contraste de phase à l’aide d’un microscope à fond clair (Figure 4C) avant de les traiter pour l’analyse par immunofluorescence afin de garantir la qualité de la préparation (Figure 4D).
3. Analyse par immunocytofluorescence
   1. Retirez délicatement le milieu, lavez deux fois les cellules qui ont été cultivées sur lame de chambre avec 100 μL de 1x PBS et fixez-les avec 100 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % à RT pendant 1 h.
      REMARQUE : Cette étape doit être effectuée avec soin. Un petit volume de milieu doit toujours être conservé dans la chambre pour éviter de stresser les cellules, et le PBS doit être versé à travers les parois de la chambre.
   2. Lavez les cellules trois fois avec 100 μL de PBS 1x, complété par 0,1 % de Tween 20 (PBST) pour perméabiliser les membranes cellulaires.
   3. Bloquer les signaux non spécifiques par incubation dans 100 μL de 1x PBST complété par 5% de FCS (PBST-FCS) à RT pendant 1 h.
   4. Incuber les cellules avec 100 μL d’un mélange maître d’anticorps anti-PAX7 et anti-dystrophine (DMD) (dilués dans 1x PBST-FCS) à 4 °C pendant la nuit, pour détecter les cellules satellites et les myofibres, respectivement.
   5. Laver les cellules trois fois avec 100 μL de PBST 1x et les incuber avec 100 μL d’anticorps secondaires anti-souris Cy3 de chèvre ou anti-lapin de chèvre Alexa 488 (tableau 3) dilués dans 1x PBST-FCS à RT pendant 1 h.
   6. Dissocier les puits de la chambre de la lame à l’aide de l’équipement fourni par le fournisseur, ajouter 20 μL de milieu de montage aqueux avec du 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et recouvrir la lame d’une lamelle (tableau 1).
   7. Observez et capturez l’image des cellules colorées à l’aide d’un microscope confocal.
   8. Traiter les images à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images (figures 4B, D).

3. Analyse CUT&RUN

1. Préparation d’échantillons pour l’analyse CUT&RUN sur des cellules satellites isolées de FACS
   REMARQUE : CUT&RUN a été exécuté essentiellement comme décrit^10,15. La composition du tampon est présentée en Tableau 2.
   1. Pour le test CUT&RUN, utiliser environ 40 000 des cellules obtenues à l’étape 1.5.9 de la méthode 1, par échantillon/anticorps à tester.
   2. Centrifuger les cellules satellites isolées par FACS à RT à 500 x g pendant 10 min, puis jeter le surnageant à l’aide d’une pipette (volume de pointe de 20 à 200 μL).
   3. Laver les cellules avec 1 mL de PBS 1x, centrifuger à RT à 500 x g pendant 5 min, jeter le surnageant à l’aide d’une pipette (volume de pointe de 0,2 à 1 mL) et les remettre en suspension dans 1 mL de tampon d’extraction nucléaire à froid (tableau 2). Incuber sur glace pendant 20 min.
   4. Pendant l’incubation, préparer un tube de 1,5 mL contenant 850 μL de tampon de liaison à froid (tableau 2) et ajouter 20 μL de billes magnétiques enrobées de concanavaline A par échantillon (tableau 1).
   5. Lavez les billes deux fois avec 1 mL de tampon de liaison à froid à l’aide d’une grille magnétique (tableau 1). Pour chaque lavage ou changement de tampon tout au long de la procédure, laissez les billes s’accumuler sur le côté du tube sur la grille magnétique pendant 5 minutes avant de retirer le surnageant dégagé avec une pipette (volume de pointe de 0,2 à 1 ml). Ensuite, remettre délicatement en suspension dans 300 μL de tampon de liaison à froid.
   6. Centrifuger les noyaux à 4 °C à 600 x g pendant 5 min et les remettre en suspension délicatement dans 600 μL de tampon d’extraction nucléaire. Mélanger délicatement les 600 μL de noyaux extraits avec les 300 μL de bouillie de concanavaline A et incuber à 4 °C pendant 10 min.
   7. Retirer le surnageant à l’aide d’une grille magnétique, comme décrit à l’étape 3.1.4, et remettre doucement en suspension les noyaux liés aux billes avec 1 mL de tampon bloquant le froid (tableau 2). Incuber à RT pendant 5 min.
   8. Retirer le surnageant à l’aide d’une grille magnétique et laver deux fois les noyaux liés aux billes avec 1 mL de tampon de lavage à froid (tableau 2). Lors du deuxième lavage, divisez également les noyaux liés aux billes en tubes de 1,5 ml. Chaque tube sera traité avec un anticorps spécifique à l’étape suivante.
      REMARQUE : Dans cet exemple, 250 μL de noyaux liés aux billes ont été divisés en quatre tubes de 1,5 mL.
   9. Séparez le surnageant à l’aide d’une grille magnétique, comme décrit à l’étape 3.1.4, et aspirez à l’aide d’une pipette. Remettre doucement en suspension les complexes noyau/billes avec un anticorps primaire spécifique (tableau 3), ou une IgG d’une autre espèce (ici lapin) diluée dans 250 μL de tampon de lavage à froid. Incuber à 4 °C pendant la nuit en agitant doucement.
      REMARQUE : Les anticorps utilisés ici sont dirigés contre AR, H3K4me2 et H3K27ac.
   10. Retirer le surnageant à l’aide d’une grille magnétique, comme décrit à l’étape 3.1.4, laver deux fois les noyaux liés aux billes avec 1 mL de tampon de lavage à froid et remettre en suspension 100 μL de tampon de lavage à froid.
   11. Diluer la nucléase de la protéine A-micrococcique à 1,4 ng/μL dans 100 μL par échantillon de tampon de lavage à froid.
   12. Ajouter 100 μL de nucléase micrococcique de protéine A aux 100 μL d’échantillon obtenus en 3.1.11 et incuber à 4 °C pendant 1 h avec agitation.
   13. Retirer le surnageant à l’aide d’une grille magnétique, comme décrit à l’étape 3.1.4, laver deux fois avec 1 mL de tampon de lavage à froid et remettre en suspension les noyaux liés aux billes dans 150 μL de tampon de lavage à froid.
   14. Pour amorcer le clivage de l’ADN, ajouter 3 μL de 100 mM de CaCl₂ aux 150 μL de l’échantillon, mélanger rapidement par effleurement et incuber sur de la glace pendant 30 minutes. Arrêtez la réaction en ajoutant 150 μL de tampon d’arrêt et incubez à 37 °C pendant 20 min pour digérer l’ARN et libérer les fragments d’ADN.
   15. Pour l’extraction de l’ADN, centrifugez les échantillons à 16 000 x g à 4 °C pendant 5 min.
   16. Transférez le surnageant dans un nouveau tube de microfuge et jetez la pastille et les billes.
   17. Ajouter 3 μL de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 10 % et 2,5 μL de protéinase K à 20 mg/mL. Mélanger par inversion. Incuber pendant 10 min à 70 °C (sans agitation).
   18. Ajouter 300 μL de phénol/chloroforme/alcool isoamylique, le vortex, transférer dans des tubes à verrouillage de phase de 2 mL (pré-essorés pendant 5 min à 16 000 x g) et centrifuger pendant 5 min à 16 000 x g à 4 °C.
   19. Ajouter 300 μL de chloroforme dans le même tube et centrifuger pendant 5 min à 16 000 x g à 4 °C. Prélever le surnageant (~300 μL) à l’aide d’une pipette (volume de pointe de 0,2 à 1 mL) et transférer dans un nouveau tube de 1,5 mL.
   20. Ajouter 1 μL de glycogène (concentration de 20 mg/mL).
   21. Ajouter 750 μL d’éthanol à 100 % et précipiter pendant la nuit à -20 °C.
   22. Granuler l’ADN par centrifugation pendant 15 min à 16 000 x g à 4 °C. Lavez la pastille avec 1 mL d’éthanol à 100 %, centrifugez pendant 5 min à 16 000 x g, jetez le surnageant, centrifugez pendant 30 s à 16 000 x g et retirez le liquide à l’aide d’une pipette (volume de pointe de 20 à 200 μL).
   23. Séchez le granulé à l’air libre pendant ~5 min. Remettre en suspension dans 25 μL de 1 mM de Tris-HCl (pH 8) et de 0,1 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA ; pH 8).
2. Analyse bioinformatique
   1. Préparez des banques à partir d’ADN clivé et séquencez-les sous forme de lectures appariées de 100 pb à l’aide de la plate-forme génomique décrite¹⁶.
   2. Supprimez les lectures qui se chevauchent avec la région de la liste noire ENCODE (V2) et séparez les lectures restantes en deux groupes : la taille des fragments <120 pb (sans nucléosome, en général pour les facteurs de transcription) et la taille des fragments >150 pb (avec les nucléosomes, normalement pour les marques d’histones). Cartographier le génome de référence mm10 à l’aide de Bowtie 2 (v2.3.4.3)¹⁷.
   3. Générez des fichiers bigwig avec bamCoverage (deeptools 3.3.0 : bamCoverage --normalizeUsing RPKM --binSize 20).
   4. Conservez les lectures mappées de manière unique pour une analyse plus approfondie.
   5. Générez des fichiers bedgraph bruts avec genomeCoverageBed (bedtools v2.26.0).
   6. Utilisez l’algorithme SEACR 1.3 (option stricte) pour les pics d’appel. Chargez le fichier de bedgraph de données cible au format de bedgraph UCSC qui omet les régions contenant un signal nul, et le fichier de bedgraph de données de contrôle (IgG) pour générer un seuil empirique pour l’appel de crête¹⁸.
   7. Effectuer une analyse de corrélation de Pearson à l’aide de deeptools pour déterminer la similarité entre les échantillons¹⁹. Utilisez la ligne de commande multiBamSummary bins --bamfiles file1.bam file2.bam -o results.npz, suivie de plotCorrelation -in results.npz --corMethod pearson --skipZeros --plotTitle « Pearson Correlation of Read Counts » --whatToPlot heatmap --colorMap RdYlBu --plotNumbers -o heatmap_PearsonCorr_readCounts.png --outFileCorMatrix PearsonCorr_readCounts.tab.
   8. Visualisez les profils d’intensité à l’échelle du génome avec IGV²⁰ à l’aide de fichiers bedgraph et des pics de bed file obtenus à partir de SEACR.
   9. Utilisez HOMER pour l’annotation des pics et la recherche de motifs²¹.
   10. Enfin, comparez les jeux de données avec ceux précédemment publiés avec le navigateur ChIP-Atlas Peak pour les visualiser sur IGV, et/ou l’analyse d’enrichissement en utilisant les fichiers bed générés par SEASCR comme jeu de données d’entrée²².

Résultats

Des cellules satellites provenant de muscles squelettiques de souris ont été isolées en combinant les protocoles de Gunther et al. (ci-après le Protocole 1)¹² et de Liu et ^al.23 (ci-après le Protocole 2). Étant donné que des fibres musculaires non digérées ont été observées après la digestion lors de l’utilisation de la concentration de collagénase et de dispase proposée dans le protocole 1, la quantité d’enzymes a été augmentée pour améliorer la dis...

Discussion

La présente étude fait état d’une méthode standardisée, fiable et facile à réaliser pour l’isolement et la culture de cellules satellites de souris, ainsi que l’évaluation de la régulation transcriptionnelle par la méthode CUT&RUN.

Ce protocole comporte plusieurs étapes critiques. Le premier est la perturbation musculaire et la digestion des fibres pour assurer un nombre élevé de cellules collectées. Malgré l’augmentation de la concentration enzymatique, plus de cellules...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microtube	Eppendorf	2080422
2 mL microtube	Star Lab	S1620-2700
5 mL tubes	CORNING-FALCON	352063
50 mL tubes	Falcon	352098
anti-AR	abcam	ab108341
anti-CD11b	eBioscience	25-0112-82
anti-CD31	eBioscience	12-0311-82
anti-CD34	eBioscience	48-0341-82
anti-CD45	eBioscience	12-0451-83
anti-CXCR4	eBioscience	17-9991-82
anti-DMD	abcam	ab15277
anti-H3K27ac	Active Motif	39133
anti-H3K4me2	Active Motif	39141
anti-ITGA7	MBL	k0046-4
anti-PAX7	DSHB	AB_528428
anti-TER119	BD Pharmingen TM	553673
Beads	Polysciences	86057-3	BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µm	Corning®	431752
Cell Strainer 40 µm	Corning®	431750
Cell Strainer 70 µm	Corning®	431751
Centrifuge 1	Eppendorf	521-0011	Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2	Eppendorf	5805000010	Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System	ThermoFischer	171080	Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agent	Sigma	SLBQ7780V	RNaseZAPTM
Collagenase, type I	Thermo Fisher	17100017	10 mg/mL
Dispase	STEMCELL technologies	7913	5 U/mL
DynaMag™-2 Aimant	Invitrogen	12321D
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	565388
Flow cytometer	BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer	23-14816-01
Fluoromount G with DAPI	Invitrogen	00-4959-52
Genome browser	IGV		http://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Hydrogel	Corning®	354277	Matrigel hESC qualified matrix
Image processing software	Image J®		V 1.8.0
Laboratory film	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	PARAFILM® M
Liberase LT	Roche	5401020001
Propyl gallate	Sigma-Aldrich	2370
Sequencer	Illumina Hiseq 4000	SY-401-4001
Shaking water bath	Bioblock Scientific polytest 20	18724