פרוטוקול יעיל לניתוח CUT&RUN של תאי לוויין עכבר מבודדים ב-FAC

Summary

מוצג כאן פרוטוקול יעיל לבידוד תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) של תאי לוויין של שרירי גפיים עכבריים המותאם לחקר ויסות שעתוק בסיבי שריר על ידי שסע מתחת למטרות ושחרור באמצעות נוקלאז (CUT&RUN).

Abstract

ניתוחים גנומיים עם אוכלוסיות תאים קטנות הם אילוץ מרכזי למחקרים, במיוחד בתחום תאי הגזע. עבודה זו מתארת פרוטוקול יעיל לבידוד תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) של תאי לוויין משריר הגפיים, רקמה עם תכולה גבוהה של חלבונים מבניים. שרירי גפיים מנותחים מעכברים בוגרים שובשו מכנית על ידי טחינה במדיום בתוספת דיספאס וקולגנאז מסוג I. עם העיכול, ההומוגנט סונן דרך מסננות תאים, והתאים הושעו במאגר FACS. הכדאיות נקבעה עם כתם כדאיות הניתן לתיקון, ותאי לוויין מוכתמים חיסונית בודדו על ידי FACS. התאים עברו ליזה עם Triton X-100 וגרעינים ששוחררו נקשרו לחרוזים מגנטיים מסוג concanavalin A. קומפלקסים של גרעין/חרוזים הודגרו עם נוגדנים כנגד גורם השעתוק או שינויי ההיסטון המעניינים. לאחר השטיפה, קומפלקסים של גרעין/חרוזים הודגרו עם חלבון A-micrococcal nuclease, ומחשוף הכרומטין החל עם CaCl₂. לאחר מיצוי הדנ"א נוצרו ורוצפו ספריות, והפרופילים לקשירת פקטורי שעתוק ברחבי הגנום ושינויים קוולנטיים בהיסטון התקבלו על ידי אנליזה ביואינפורמטית. הפסגות שהתקבלו עבור סימני ההיסטון השונים הראו כי אירועי הקישור היו ספציפיים לתאי לוויין. יתר על כן, ניתוח מוטיב ידוע גילה כי גורם השעתוק קשור לכרומטין באמצעות אלמנט התגובה הקוגנטית שלו. פרוטוקול זה מותאם אפוא לחקר בקרת גנים בתאי לוויין של שרירי גפיים של עכברים בוגרים.

Introduction

שרירי השלד המפוספסים מייצגים בממוצע 40% ממשקל גוף האדם הכולל¹. סיבי שריר מפגינים יכולת יוצאת דופן להתחדשות בעת פציעה, המתוארת על ידי איחוי של מיוציטים חדשים שנוצרו ויצירת מיוסיבים חדשים המחליפים את הפגועים². בשנת 1961 דיווח אלכסנדר מאורו על אוכלוסייה של תאים חד-גרעיניים שאותם כינה תאי לוויין³. תאי גזע אלה מבטאים את פקטור השעתוק בתיבה 7 (PAX7), וממוקמים בין הלמינה הבסיסית לבין הסרקולמה של סיבי שריר⁴. הם דווחו כמבטאים את אשכול ההתמיינות 34 (CD34; אב המטופוייטי, אנדותל וסמן תאי גזע מזנכימליים), אינטגרין אלפא 7 (ITGA7; סמן שרירי לב ושלד חלקים), כמו גם קולטן כימוקין C-X-C מסוג 4....

Protocol

עכברים הוחזקו בבית חיות מוכר, בהתאם להנחיות הלאומיות לטיפול בבעלי חיים (הנחיה 86/609/CEE של הנציבות האירופית; צו צרפתי מס '87-848) על השימוש בחיות מעבדה למחקר. מניפולציות מכוונות הוגשו לוועדה האתית (Com'Eth, שטרסבורג, צרפת) ולמשרד המחקר הצרפתי (MESR) להערכה ואישור אתיים בהתאם להנחיית 2010/63/EU תחת מספר APAFIS #22.......

Discussion

המחקר הנוכחי מדווח על שיטה סטנדרטית, אמינה וקלה לביצוע לבידוד ותרבית של תאי לוויין עכברים, כמו גם על הערכת ויסות שעתוק בשיטת CUT&RUN.

פרוטוקול זה כולל מספר שלבים קריטיים. הראשון הוא הפרעה בשרירים ועיכול סיבים כדי להבטיח מספר גבוה של תאים שנאספו. למרות ריכוז האנזימים המוגבר, התק?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microtube	Eppendorf	2080422
2 mL microtube	Star Lab	S1620-2700
5 mL tubes	CORNING-FALCON	352063
50 mL tubes	Falcon	352098
anti-AR	abcam	ab108341
anti-CD11b	eBioscience	25-0112-82
anti-CD31	eBioscience	12-0311-82
anti-CD34	eBioscience	48-0341-82
anti-CD45	eBioscience	12-0451-83
anti-CXCR4	eBioscience	17-9991-82
anti-DMD	abcam	ab15277
anti-H3K27ac	Active Motif	39133
anti-H3K4me2	Active Motif	39141
anti-ITGA7	MBL	k0046-4
anti-PAX7	DSHB	AB_528428
anti-TER119	BD Pharmingen TM	553673
Beads	Polysciences	86057-3	BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µm	Corning®	431752
Cell Strainer 40 µm	Corning®	431750
Cell Strainer 70 µm	Corning®	431751
Centrifuge 1	Eppendorf	521-0011	Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2	Eppendorf	5805000010	Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System	ThermoFischer	171080	Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agent	Sigma	SLBQ7780V	RNaseZAPTM
Collagenase, type I	Thermo Fisher	17100017	10 mg/mL
Dispase	STEMCELL technologies	7913	5 U/mL
DynaMag™-2 Aimant	Invitrogen	12321D
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	565388
Flow cytometer	BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer	23-14816-01
Fluoromount G with DAPI	Invitrogen	00-4959-52
Genome browser	IGV		http://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Hydrogel	Corning®	354277	Matrigel hESC qualified matrix
Image processing software	Image J®		V 1.8.0
Laboratory film	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	PARAFILM® M
Liberase LT	Roche	5401020001
Propyl gallate	Sigma-Aldrich	2370
Sequencer	Illumina Hiseq 4000	SY-401-4001
Shaking water bath	Bioblock Scientific polytest 20	18724