FACS-पृथक माउस उपग्रह कोशिकाओं के CUT &RUN विश्लेषण के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल

Summary

यहां प्रस्तुत माउस अंग मांसपेशी उपग्रह कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) अलगाव के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल है जो लक्ष्य के तहत दरार द्वारा मांसपेशी फाइबर में प्रतिलेखन विनियमन के अध्ययन के लिए अनुकूलित है और न्यूक्लियस (कट एंड रन) का उपयोग करके रिलीज करता है।

Abstract

छोटे सेल आबादी के साथ जीनोम-व्यापक विश्लेषण अध्ययन के लिए एक प्रमुख बाधा है, खासकर स्टेम सेल क्षेत्र में। यह काम अंग की मांसपेशियों से उपग्रह कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) अलगाव के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, संरचनात्मक प्रोटीन की उच्च सामग्री वाला ऊतक। वयस्क चूहों से विच्छेदित अंग की मांसपेशियों को यांत्रिक रूप से डिस्पैस और टाइप 1 कोलेजनेस के साथ पूरक माध्यम में घुमाकर बाधित किया गया था। पाचन पर, होमोजेनेट को सेल स्ट्रेनर्स के माध्यम से फ़िल्टर किया गया था, और कोशिकाओं को एफएसीएस बफर में निलंबित कर दिया गया था। व्यवहार्यता को ठीक करने योग्य व्यवहार्यता दाग के साथ निर्धारित किया गया था, और इम्यूनोस्टेन्ड उपग्रह कोशिकाओं को एफएसीएस द्वारा अलग किया गया था। कोशिकाओं को ट्राइटन एक्स -100 के साथ जोड़ा गया था और जारी नाभिक को कोनकानावेलिन ए चुंबकीय मोतियों से बांधा गया था। न्यूक्लियस /बीड कॉम्प्लेक्स को प्रतिलेखन कारक या रुचि के हिस्टोन संशोधनों के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया गया था। धोने के बाद, न्यूक्लियस / बीड कॉम्प्लेक्स को प्रोटीन ए-माइक्रोकोकल न्यूक्लियस के साथ इनक्यूबेट किया गया था, और क्रोमैटिन क्लीवेज को सीएसीएल₂ के साथ शुरू किया गया था। डीएनए निष्कर्षण के बाद, पुस्तकालयों को उत्पन्न और अनुक्रमित किया गया था, और जीनोम-वाइड ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर बाइंडिंग और सहसंयोजक हिस्टोन संशोधनों के लिए प्रोफाइल जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण द्वारा प्राप्त किए गए थे। विभिन्न हिस्टोन चिह्नों के लिए प्राप्त चोटियों से पता चला कि बाध्यकारी घटनाएं उपग्रह कोशिकाओं के लिए विशिष्ट थीं। इसके अलावा, ज्ञात आकृति विश्लेषण ने खुलासा किया कि प्रतिलेखन कारक अपने आत्मीय प्रतिक्रिया तत्व के माध्यम से क्रोमैटिन से बंधा था। इसलिए यह प्रोटोकॉल वयस्क चूहों के अंग मांसपेशी उपग्रह कोशिकाओं में जीन विनियमन का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित है।

Introduction

कंकाल धारीदार मांसपेशियां कुल^{मानव शरीर के} वजन का औसतन 40% प्रतिनिधित्व करती हैं। मांसपेशी फाइबर चोट पर पुनर्जनन के लिए एक उल्लेखनीय क्षमता प्रदर्शित करते हैं, जिसे नवगठित मायोसाइट्स के संलयन और नए मायोफाइबर की पीढ़ी द्वारा वर्णित किया जाता है जो^{क्षतिग्रस्त लोगों को} प्रतिस्थापित करते हैं2। 1961 में, अलेक्जेंडर माउरो ने मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं की आबादी की सूचना दी जिसे उन्होंने उपग्रह कोशिका³ कहा। ये स्टेम सेल प्रतिलेखन कारक युग्मित बॉक्स 7 (पैक्स 7) को व्यक्त करते हैं, और बेसल लैमिना और मांसपेशी फाइबर⁴ के सरकोलेममा के बीच स्थित होते हैं। उन्हें भेदभाव 34 (सीडी 34; एक हेमटोपो....

Protocol

चूहों को राष्ट्रीय पशु देखभाल दिशानिर्देशों (यूरोपीय आयोग के निर्देश 86/609 / सीईई) के अनुपालन में एक मान्यता प्राप्त पशु घर में रखा गया था; अनुसंधान के लिए प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग पर फ्रांसीसी डिक्री ?.......

Discussion

वर्तमान अध्ययन माउस उपग्रह कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति के लिए एक मानकीकृत, विश्वसनीय और आसानी से प्रदर्शन करने वाली विधि की रिपोर्ट करता है, साथ ही साथ कट एंड रन विधि द्वारा ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microtube	Eppendorf	2080422
2 mL microtube	Star Lab	S1620-2700
5 mL tubes	CORNING-FALCON	352063
50 mL tubes	Falcon	352098
anti-AR	abcam	ab108341
anti-CD11b	eBioscience	25-0112-82
anti-CD31	eBioscience	12-0311-82
anti-CD34	eBioscience	48-0341-82
anti-CD45	eBioscience	12-0451-83
anti-CXCR4	eBioscience	17-9991-82
anti-DMD	abcam	ab15277
anti-H3K27ac	Active Motif	39133
anti-H3K4me2	Active Motif	39141
anti-ITGA7	MBL	k0046-4
anti-PAX7	DSHB	AB_528428
anti-TER119	BD Pharmingen TM	553673
Beads	Polysciences	86057-3	BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µm	Corning®	431752
Cell Strainer 40 µm	Corning®	431750
Cell Strainer 70 µm	Corning®	431751
Centrifuge 1	Eppendorf	521-0011	Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2	Eppendorf	5805000010	Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System	ThermoFischer	171080	Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agent	Sigma	SLBQ7780V	RNaseZAPTM
Collagenase, type I	Thermo Fisher	17100017	10 mg/mL
Dispase	STEMCELL technologies	7913	5 U/mL
DynaMag™-2 Aimant	Invitrogen	12321D
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	565388
Flow cytometer	BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer	23-14816-01
Fluoromount G with DAPI	Invitrogen	00-4959-52
Genome browser	IGV		http://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Hydrogel	Corning®	354277	Matrigel hESC qualified matrix
Image processing software	Image J®		V 1.8.0
Laboratory film	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	PARAFILM® M
Liberase LT	Roche	5401020001
Propyl gallate	Sigma-Aldrich	2370
Sequencer	Illumina Hiseq 4000	SY-401-4001
Shaking water bath	Bioblock Scientific polytest 20	18724