FACS単離マウスサテライト細胞のCUT&RUN解析のための効率的なプロトコール

Summary

ここでは、マウス四肢筋サテライト細胞の蛍光活性化細胞選別(FACS)単離のための効率的なプロトコルを、標的下での切断とヌクレアーゼを用いた放出による筋線維の転写制御の研究に適合させます(CUT&RUN)。

Abstract

小細胞集団を用いたゲノムワイド解析は、特に幹細胞分野における研究にとって大きな制約となります。この研究は、構造タンパク質を多く含む組織である四肢筋からのサテライト細胞の蛍光活性化細胞選別(FACS)分離のための効率的なプロトコルについて説明しています。成体マウスの四肢の筋肉を解剖し、ディスパーゼおよびI型コラゲナーゼを添加した培地でミンチすることにより機械的に破壊した。消化後、ホモジネートをセルストレーナーでろ過し、細胞をFACSバッファーに懸濁しました。生存率は固定可能な生存率染色で決定し、免疫染色したサテライト細胞をFACSで単離しました。細胞をTriton X-100で溶解し、放出した核をコンカナバリンA磁気ビーズに結合させました。核/ビーズ複合体を、目的の転写因子またはヒストン修飾に対する抗体とインキュベートしました。洗浄後、核/ビーズ複合体をプロテインA-ミクロコッカスヌクレアーゼとインキュベートし、CaCl₂でクロマチン切断を開始しました。DNA抽出後、ライブラリーを作製・配列決定し、ゲノムワイドな転写因子結合と共有結合ヒストン修飾のプロファイルをバイオインフォマティクス解析により取得しました。さまざまなヒストンマークについて得られたピークは、結合イベントがサテライト細胞に特異的であることを示しています。さらに、既知のモチーフ解析により、転写因子が同族の応答要素 を介して クロマチンに結合していることが明らかになりました。従ってこのプロトコルは大人のマウスの四肢筋肉衛星細胞の遺伝子の規則を調査するために合わせられる。

Introduction

骨格横紋筋は、平均して^{人体全体の}重量の40%を占めています1。筋線維は、新たに形成された筋細胞の融合と、損傷^した筋線維を置き換える新しい筋線維の生成によって説明される、損傷時に驚くべき再生能力を示す2。1961年、アレクサンダー・マウロは単核細胞の集団を報告し、これをサテライト細胞³と名付けた。これらの幹細胞は、転写因子ペアボックス7(PAX7)を発現し、筋線維⁴の基底層と筋膜の間に位置する。分化クラスター34(CD34;造血、内皮前駆細胞、間葉系幹細胞マーカー)、インテグリンα7(ITGA7;平滑心筋マーカー、骨格筋マーカー)、C-X-Cケモカイン受容体4型(CXCR4;リンパ球、造血、サテライト細胞マーカー)⁵を発現していることが報告されています。基底状態では、サテライト細胞は^{静止状態を維持する}特定の微小環境に存在します6。筋肉が損傷すると、それらは活性化され、増殖し、筋形成を受け^ます7。しかし、筋肉細胞の総数のごく一部にしか寄与していないため、ゲノムワイドな解析は、特に生理学的設定(全細胞の<1%)では特に困難です。

サテライト細胞からクロ....

Protocol

マウスは、国家動物管理ガイドライン(欧州委員会指令86/609 / CEE;研究のための実験動物の使用に関するフランス政令第87-848号。意図された操作は、APAFIS 番号 #22281 に基づく 2010/63/EU 指令に従って倫理的評価と承認を受けるために、倫理委員会 (Com'Eth、ストラスブール、フランス) およびフランス研究省 (MESR) に提出されました。

1. 蛍光活性化セルソーティング(FACS)に?.......

Discussion

本研究は、マウスサテライト細胞の単離と培養、ならびにCUT&RUN法による転写制御の評価のための標準化された信頼性と実施が容易な方法を報告する。

このプロトコルには、いくつかの重要なステップが含まれます。1つ目は、筋肉の破壊と繊維の消化で、多くの細胞を確実に集めることです。酵素濃度が上昇したにもかかわらず、プロトコル1を使用した場合よりも多く?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microtube	Eppendorf	2080422
2 mL microtube	Star Lab	S1620-2700
5 mL tubes	CORNING-FALCON	352063
50 mL tubes	Falcon	352098
anti-AR	abcam	ab108341
anti-CD11b	eBioscience	25-0112-82
anti-CD31	eBioscience	12-0311-82
anti-CD34	eBioscience	48-0341-82
anti-CD45	eBioscience	12-0451-83
anti-CXCR4	eBioscience	17-9991-82
anti-DMD	abcam	ab15277
anti-H3K27ac	Active Motif	39133
anti-H3K4me2	Active Motif	39141
anti-ITGA7	MBL	k0046-4
anti-PAX7	DSHB	AB_528428
anti-TER119	BD Pharmingen TM	553673
Beads	Polysciences	86057-3	BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µm	Corning®	431752
Cell Strainer 40 µm	Corning®	431750
Cell Strainer 70 µm	Corning®	431751
Centrifuge 1	Eppendorf	521-0011	Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2	Eppendorf	5805000010	Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System	ThermoFischer	171080	Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agent	Sigma	SLBQ7780V	RNaseZAPTM
Collagenase, type I	Thermo Fisher	17100017	10 mg/mL
Dispase	STEMCELL technologies	7913	5 U/mL
DynaMag™-2 Aimant	Invitrogen	12321D
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	565388
Flow cytometer	BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer	23-14816-01
Fluoromount G with DAPI	Invitrogen	00-4959-52
Genome browser	IGV		http://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Hydrogel	Corning®	354277	Matrigel hESC qualified matrix
Image processing software	Image J®		V 1.8.0
Laboratory film	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	PARAFILM® M
Liberase LT	Roche	5401020001
Propyl gallate	Sigma-Aldrich	2370
Sequencer	Illumina Hiseq 4000	SY-401-4001
Shaking water bath	Bioblock Scientific polytest 20	18724