FACS 분리 마우스 위성 세포의 CUT&RUN 분석을 위한 효율적인 프로토콜

Summary

여기에 제시된 것은 뉴클레아제를 사용한 표적 절단 및 방출에 의한 근육 섬유의 전사 조절 연구에 적합한 마우스 사지 근육 위성 세포의 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분리를 위한 효율적인 프로토콜입니다(CUT&RUN).

Abstract

작은 세포 집단을 사용한 게놈 전체 분석은 특히 줄기 세포 분야에서 연구의 주요 제약 조건입니다. 이 연구는 구조 단백질 함량이 높은 조직인 사지 근육에서 위성 세포를 분리하는 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 위한 효율적인 프로토콜을 설명합니다. 성인 마우스에서 절개된 사지 근육은 dispase 및 type I 콜라겐분해효소가 보충된 배지에서 다져서 기계적으로 파괴되었습니다. 분해 시, 균질액을 세포 스트레이너를 통해 여과하고, 세포를 FACS 완충액에 현탁시켰다. 생존율은 고정 가능한 생존도 염색으로 측정하고, 면역염색된 위성 세포는 FACS로 분리했습니다. 세포를 Triton X-100으로 용해시키고 방출된 핵을 콘카나발린 A 자성 비드에 결합시켰습니다. 핵/비드 복합체는 전사 인자 또는 관심 히스톤 변형에 대한 항체와 함께 배양되었습니다. 세척 후, 핵/비드 복합체를 단백질 A-마이크로코커스 뉴클레아제로 배양하고, 염색질 절단은 CaCl₂로 개시하였다. DNA 추출 후, 라이브러리를 생성하고 서열을 분석하고, 생물정보학 분석을 통해 게놈 전체 전사 인자 결합 및 공유 히스톤 변형에 대한 프로파일을 얻었다. 다양한 히스톤 마크에 대해 얻은 피크는 결합 이벤트가 위성 세포에 특이적임을 보여주었습니다. 또한, 알려진 모티프 분석은 전사 인자가 동족 반응 요소를 통해 염색질에 결합되어 있음을 밝혔습니다. 따라서 이 프로토콜은 성체 마우스 사지 근육 위성 세포의 유전자 조절을 연구하는 데 적합합니다.

Introduction

골격근은 평균 인체 전체 체중의 40%를 차지한다¹. 근섬유는 손상 시 현저한 재생 능력을 나타내는데, 이는 새로 형성된 근세포의 융합과 손상된 근섬유를 대체하는 새로운 근섬유의 생성으로 설명된다². 1961년, 알렉산더 마우로(Alexander Mauro)는 위성 세포(satellite cell)라고 명명한 단핵 세포(mononuclear cell)의 집단을 보고했다.³ 이들 줄기세포는 전사인자 쌍을 이루는 상자7(PAX7)을 발현하며, 근섬유의 기저층(basal lamina)과 근섬유(sarcolemma) 사이에^{위치한다4}. 이들은 분화 클러스터 34(CD34, 조혈, 내피 전구 세포 및 중간엽 줄기 세포 마커), 인테그린 알파 7(ITGA7, 부드러운 심장 및 골격근 마커) 및 C-X-C 케모카인 수용체 유형 4(CXCR4, 림프구, 조혈 및 위성 세포 마커)⁵를 발현하는 것으로 보고되었습니다. 기초 조건에서, 위성 세포는 정지 상태를 유지하는 특정 미세환경에 상주한다⁶. 근육이 손상되면 근육이 활성화되고 증식하며 근육 형성을 겪는다<....

Protocol

생쥐는 국가 동물 관리 지침(유럽연합 집행위원회 지침 86/609/CEE; 프랑스 법령 no.87-848) 연구를 위한 실험실 동물 사용에 관한 것입니다. 의도된 조작은 APAFIS 번호 #22281에 따라 2010/63/EU 지침에 따라 윤리적 평가 및 승인을 위해 윤리 위원회(Com'Eth, Strasbourg, France) 및 프랑스 연구부(MESR)에 제출되었습니다.

1. 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의한 위성 세포 분리를 위한 세포 현탁.......

Discussion

본 연구는 마우스 위성 세포의 분리 및 배양을 위한 표준화되고 신뢰할 수 있으며 수행하기 쉬운 방법과 CUT&RUN 방법에 의한 전사 조절 평가를 보고합니다.

이 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 포함됩니다. 첫 번째는 근육 파괴와 섬유질 소화를 통해 많은 수의 세포를 수집할 수 있도록 하는 것입니다. 효소 농도가 증가했음에도 불구하고, 프로토콜 1을 사용한 것보다 더 많.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microtube	Eppendorf	2080422
2 mL microtube	Star Lab	S1620-2700
5 mL tubes	CORNING-FALCON	352063
50 mL tubes	Falcon	352098
anti-AR	abcam	ab108341
anti-CD11b	eBioscience	25-0112-82
anti-CD31	eBioscience	12-0311-82
anti-CD34	eBioscience	48-0341-82
anti-CD45	eBioscience	12-0451-83
anti-CXCR4	eBioscience	17-9991-82
anti-DMD	abcam	ab15277
anti-H3K27ac	Active Motif	39133
anti-H3K4me2	Active Motif	39141
anti-ITGA7	MBL	k0046-4
anti-PAX7	DSHB	AB_528428
anti-TER119	BD Pharmingen TM	553673
Beads	Polysciences	86057-3	BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µm	Corning®	431752
Cell Strainer 40 µm	Corning®	431750
Cell Strainer 70 µm	Corning®	431751
Centrifuge 1	Eppendorf	521-0011	Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2	Eppendorf	5805000010	Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System	ThermoFischer	171080	Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agent	Sigma	SLBQ7780V	RNaseZAPTM
Collagenase, type I	Thermo Fisher	17100017	10 mg/mL
Dispase	STEMCELL technologies	7913	5 U/mL
DynaMag™-2 Aimant	Invitrogen	12321D
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	565388
Flow cytometer	BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer	23-14816-01
Fluoromount G with DAPI	Invitrogen	00-4959-52
Genome browser	IGV		http://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Hydrogel	Corning®	354277	Matrigel hESC qualified matrix
Image processing software	Image J®		V 1.8.0
Laboratory film	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	PARAFILM® M
Liberase LT	Roche	5401020001
Propyl gallate	Sigma-Aldrich	2370
Sequencer	Illumina Hiseq 4000	SY-401-4001
Shaking water bath	Bioblock Scientific polytest 20	18724