En effektiv protokoll for CUT&RUN-analyse av FACS-isolerte musesatellittceller

Summary

Presentert her er en effektiv protokoll for fluorescensaktivert cellesortering (FACS) isolering av mus lem muskel satellittceller tilpasset studiet av transkripsjonsregulering i muskelfibre ved spaltning under mål og frigjøring ved bruk av nuklease (CUT &RUN).

Abstract

Genombrede analyser med småcellepopulasjoner er en viktig begrensning for studier, spesielt innen stamcellefeltet. Dette arbeidet beskriver en effektiv protokoll for fluorescensaktivert cellesortering (FACS) isolering av satellittceller fra lemmermuskelen, et vev med høyt innhold av strukturelle proteiner. Dissekerte lemmemuskler fra voksne mus ble mekanisk forstyrret ved hakking i medium supplert med dispase og type I kollagenase. Ved fordøyelsen ble homogenatet filtrert gjennom cellesiler, og celler ble suspendert i FACS-buffer. Levedyktigheten ble bestemt med fikserbar levedyktighetsflekk, og immunfargede satellittceller ble isolert av FACS. Celler ble lysert med Triton X-100 og frigjorte kjerner ble bundet til concanavalin A magnetiske perler. Kjerne-/perlekomplekser ble inkubert med antistoffer mot transkripsjonsfaktoren eller histonmodifikasjoner av interesse. Etter vask ble kjerne-/perlekomplekser inkubert med protein A-mikrokokknuklease, og kromatinspaltning ble initiert med CaCl₂. Etter DNA-ekstraksjon ble biblioteker generert og sekvensert, og profilene for genom-bred transkripsjonsfaktorbinding og kovalente histonmodifikasjoner ble oppnådd ved bioinformatisk analyse. Toppene oppnådd for de forskjellige histonmerkene viste at bindingshendelsene var spesifikke for satellittceller. Videre avslørte kjent motivanalyse at transkripsjonsfaktoren var bundet til kromatin via sitt kognitive responselement. Denne protokollen er derfor tilpasset for å studere genregulering i voksne mus lem muskel satellittceller.

Introduction

Skjelettstrikkede muskler representerer i gjennomsnitt 40% av vekten av den totale menneskekroppen¹. Muskelfibre utviser en bemerkelsesverdig evne til regenerering ved skade, som er beskrevet ved fusjon av nydannede myocytter og generering av nye myofibre som erstatter de skadede². I 1961 rapporterte Alexander Mauro en populasjon av mononukleære celler som han betegnet som satellittceller³. Disse stamcellene uttrykker transkripsjonsfaktorparet boks 7 (PAX7), og ligger mellom basal lamina og sarcolemma av muskelfibre⁴. De ble rapportert å uttrykke klyngen av differensiering ....

Protocol

Mus ble holdt i et akkreditert dyrehus, i samsvar med nasjonale retningslinjer for dyrepleie (EU-kommisjonens direktiv 86/609 / CEE; Fransk dekret nr.87-848) om bruk av forsøksdyr til forskning. Tiltenkte manipulasjoner ble sendt til den etiske komiteen (Com'Eth, Strasbourg, Frankrike) og til det franske forskningsdepartementet (MESR) for etisk evaluering og autorisasjon i henhold til 2010/63/EU-direktivet under APAFIS nummer #22281.

1. Fremstilling av cellesuspensjon for isolering av s.......

Discussion

Den foreliggende studien rapporterer en standardisert, pålitelig og enkel å utføre metode for isolering og kultur av musesatellittceller, samt vurdering av transkripsjonsregulering ved CUT&RUN-metoden.

Denne protokollen innebærer flere kritiske trinn. Den første er muskelforstyrrelser og fiberfordøyelse for å sikre et høyt antall innsamlede celler. Til tross for den økte enzymkonsentrasjonen ble det oppnådd flere levende celler enn ved bruk av protokoll 1. Satellittceller uttrykker e.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microtube	Eppendorf	2080422
2 mL microtube	Star Lab	S1620-2700
5 mL tubes	CORNING-FALCON	352063
50 mL tubes	Falcon	352098
anti-AR	abcam	ab108341
anti-CD11b	eBioscience	25-0112-82
anti-CD31	eBioscience	12-0311-82
anti-CD34	eBioscience	48-0341-82
anti-CD45	eBioscience	12-0451-83
anti-CXCR4	eBioscience	17-9991-82
anti-DMD	abcam	ab15277
anti-H3K27ac	Active Motif	39133
anti-H3K4me2	Active Motif	39141
anti-ITGA7	MBL	k0046-4
anti-PAX7	DSHB	AB_528428
anti-TER119	BD Pharmingen TM	553673
Beads	Polysciences	86057-3	BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µm	Corning®	431752
Cell Strainer 40 µm	Corning®	431750
Cell Strainer 70 µm	Corning®	431751
Centrifuge 1	Eppendorf	521-0011	Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2	Eppendorf	5805000010	Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System	ThermoFischer	171080	Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agent	Sigma	SLBQ7780V	RNaseZAPTM
Collagenase, type I	Thermo Fisher	17100017	10 mg/mL
Dispase	STEMCELL technologies	7913	5 U/mL
DynaMag™-2 Aimant	Invitrogen	12321D
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	565388
Flow cytometer	BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer	23-14816-01
Fluoromount G with DAPI	Invitrogen	00-4959-52
Genome browser	IGV		http://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Hydrogel	Corning®	354277	Matrigel hESC qualified matrix
Image processing software	Image J®		V 1.8.0
Laboratory film	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	PARAFILM® M
Liberase LT	Roche	5401020001
Propyl gallate	Sigma-Aldrich	2370
Sequencer	Illumina Hiseq 4000	SY-401-4001
Shaking water bath	Bioblock Scientific polytest 20	18724