Un protocolo eficiente para el análisis CUT&RUN de células satélite de ratón aisladas de FACS

Summary

Se presenta aquí un protocolo eficiente para el aislamiento de células satélite de músculo de extremidades de ratón con aislamiento de células satélite de células satélite de células satélite de músculo de extremidades de ratón adaptado al estudio de la regulación de la transcripción en fibras musculares por escisión bajo dianas y liberación mediante nucleasa (CUT&RUN).

Abstract

Los análisis de todo el genoma con poblaciones de células pequeñas son una limitación importante para los estudios, particularmente en el campo de las células madre. En este trabajo se describe un protocolo eficiente para el aislamiento de células satélite del músculo de la extremidad, un tejido con un alto contenido de proteínas estructurales. Los músculos disecados de las extremidades de ratones adultos se interrumpieron mecánicamente mediante la picadura en medio suplementado con dispasa y colagenasa tipo I. Tras la digestión, el homogeneizado se filtró a través de filtros celulares y las células se suspendieron en tampón FACS. La viabilidad se determinó con tinción de viabilidad fijable y las células satélite inmunoteñidas se aislaron mediante FACS. Las células se lisaron con Triton X-100 y los núcleos liberados se unieron a perlas magnéticas de concanavalina A. Los complejos núcleo/perla se incubaron con anticuerpos contra el factor de transcripción o las modificaciones de histonas de interés. Después de los lavados, los complejos núcleo/perlas se incubaron con la proteína A-microcócica nucleasa y se inició la escisión de la cromatina con CaCl₂. Después de la extracción del ADN, se generaron y secuenciaron bibliotecas, y se obtuvieron los perfiles de unión al factor de transcripción de todo el genoma y modificaciones de histonas covalentes mediante análisis bioinformático. Los picos obtenidos para las diversas marcas de histonas mostraron que los eventos de unión eran específicos para las células satélite. Además, el análisis de motivos conocidos reveló que el factor de transcripción estaba unido a la cromatina a través de su elemento de respuesta afín. Por lo tanto, este protocolo está adaptado para estudiar la regulación génica en células satélite musculares de extremidades de ratones adultos.

Introduction

Los músculos estriados esqueléticos representan en promedio el 40% del peso total del cuerpo humano¹. Las fibras musculares exhiben una notable capacidad de regeneración ante una lesión, que se describe por la fusión de miocitos recién formados y la generación de nuevas miofibras que reemplazan a las dañadas². En 1961, Alexander Mauro reportó una población de células mononucleares a las que denominó células satélite³. Estas células madre expresan el factor de transcripción pareado box 7 (PAX7), y se localizan entre la lámina basal y el sarcolema de las fibras musculares⁴. S....

Protocol

Los ratones se mantuvieron en un animalario acreditado, de acuerdo con las Directrices Nacionales de Cuidado de los Animales (Directiva 86/609/CEE de la Comisión Europea; Decreto francés nº 87-848) sobre la utilización de animales de laboratorio para la investigación. Las manipulaciones previstas se presentaron al Comité de Ética (Com'Eth, Estrasburgo, Francia) y al Ministerio de Investigación francés (MESR) para su evaluación ética y autorización de acuerdo con la directiva 2010/63/UE bajo el número APAFIS .......

Discussion

El presente estudio reporta un método estandarizado, confiable y fácil de realizar para el aislamiento y cultivo de células satélite de ratón, así como la evaluación de la regulación transcripcional por el método CUT&RUN.

Este protocolo implica varios pasos críticos. La primera es la disrupción muscular y la digestión de la fibra para garantizar un alto número de células recolectadas. A pesar del aumento de la concentración de enzimas, se obtuvieron más células vivas que utili.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microtube	Eppendorf	2080422
2 mL microtube	Star Lab	S1620-2700
5 mL tubes	CORNING-FALCON	352063
50 mL tubes	Falcon	352098
anti-AR	abcam	ab108341
anti-CD11b	eBioscience	25-0112-82
anti-CD31	eBioscience	12-0311-82
anti-CD34	eBioscience	48-0341-82
anti-CD45	eBioscience	12-0451-83
anti-CXCR4	eBioscience	17-9991-82
anti-DMD	abcam	ab15277
anti-H3K27ac	Active Motif	39133
anti-H3K4me2	Active Motif	39141
anti-ITGA7	MBL	k0046-4
anti-PAX7	DSHB	AB_528428
anti-TER119	BD Pharmingen TM	553673
Beads	Polysciences	86057-3	BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µm	Corning®	431752
Cell Strainer 40 µm	Corning®	431750
Cell Strainer 70 µm	Corning®	431751
Centrifuge 1	Eppendorf	521-0011	Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2	Eppendorf	5805000010	Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System	ThermoFischer	171080	Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agent	Sigma	SLBQ7780V	RNaseZAPTM
Collagenase, type I	Thermo Fisher	17100017	10 mg/mL
Dispase	STEMCELL technologies	7913	5 U/mL
DynaMag™-2 Aimant	Invitrogen	12321D
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	565388
Flow cytometer	BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer	23-14816-01
Fluoromount G with DAPI	Invitrogen	00-4959-52
Genome browser	IGV		http://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Hydrogel	Corning®	354277	Matrigel hESC qualified matrix
Image processing software	Image J®		V 1.8.0
Laboratory film	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	PARAFILM® M
Liberase LT	Roche	5401020001
Propyl gallate	Sigma-Aldrich	2370
Sequencer	Illumina Hiseq 4000	SY-401-4001
Shaking water bath	Bioblock Scientific polytest 20	18724