Ett effektivt protokoll för CUT&RUN-analys av FACS-isolerade mussatellitceller

Här presenteras ett effektivt protokoll för fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) isolering av muskelsatellitceller i musextremiteter anpassade för studier av transkriptionsreglering i muskelfibrer genom klyvning under mål och frisättning med hjälp av nukleas (CUT&RUN).

Genomomfattande analyser med små cellpopulationer är ett stort hinder för studier, särskilt inom stamcellsområdet. Detta arbete beskriver ett effektivt protokoll för fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) isolering av satellitceller från extremitetsmuskeln, en vävnad med ett högt innehåll av strukturella proteiner. Dissekerade extremitetsmuskler från vuxna möss stördes mekaniskt genom malning i medium kompletterat med dispase och kollagenas typ I. Vid matsmältningen filtrerades homogenatet genom cellsilar och cellerna suspenderades i FACS-buffert. Viabiliteten bestämdes med fixerbar viabilitetsfläck och immunfärgade satellitceller isolerades med FACS. Celler lyserades med Triton X-100 och frigjorda kärnor bands till konanavalin A magnetiska pärlor. Kärn-/pärlkomplex inkuberades med antikroppar mot transkriptionsfaktorn eller histonmodifieringar av intresse. Efter tvätt inkuberades kärn-/pärlkomplex med protein A-mikrokocknukleas, och kromatinklyvning initierades med CaCl₂. Efter DNA-extraktion genererades och sekvenserades bibliotek, och profilerna för genomomfattande transkriptionsfaktorbindning och kovalenta histonmodifieringar erhölls genom bioinformatisk analys. De toppar som erhölls för de olika histonmarkeringarna visade att bindningshändelserna var specifika för satellitceller. Dessutom avslöjade känd motivanalys att transkriptionsfaktorn var bunden till kromatin via dess kognata responselement. Detta protokoll är därför anpassat för att studera genreglering i vuxna mösss muskelsatellitceller.

Tvärstrimmiga skelettmuskler utgör i genomsnitt 40 % av vikten av den totala människokroppen¹. Muskelfibrer uppvisar en anmärkningsvärd förmåga till regenerering vid skada, vilket beskrivs av sammansmältningen av nybildade myocyter och genereringen av nya myofibrer som ersätter de skadade². År 1961 rapporterade Alexander Mauro en population av mononukleära celler som han kallade satellitceller³. Dessa stamceller uttrycker transkriptionsfaktorn parad box 7 (PAX7) och är belägna mellan den basala laminan och sarkolemma av muskelfibrer⁴. De rapporterades uttrycka kluster av di....

Möss hölls i ett ackrediterat djurstall, i enlighet med nationella riktlinjer för djurvård (Europeiska kommissionens direktiv 86/609/EEG; Franskt dekret nr 87-848) om användning av försöksdjur för forskning. Planerade manipulationer lämnades in till den etiska kommittén (Com'Eth, Strasbourg, Frankrike) och till det franska forskningsministeriet (MESR) för etisk utvärdering och godkännande enligt 2010/63/EU-direktivet under APAFIS-nummer #22281.

1. Beredning av cellsuspension.......

Satellitceller från musskelettmuskler isolerades genom att kombinera protokollen från Gunther et al. (nedan protokoll 1)¹² och från Liu et ^al.23 (nedan kallat protokoll 2). Eftersom icke-smälta muskelfibrer observerades efter matsmältning vid användning av den koncentration av kollagenas och dispase som föreslogs i protokoll 1, ökades mängden enzymer för att förbättra muskelfiberdissociationen, som beskrivs i steg 1.2.1 och 1.2.3. Som anges i protokoll 2 utsatte.......

Den aktuella studien redovisar en standardiserad, tillförlitlig och lättanvänd metod för isolering och odling av mussatellitceller, samt bedömning av transkriptionsreglering med CUT&RUN-metoden.

Detta protokoll omfattar flera kritiska steg. Den första är muskelstörningar och fibersmältning för att säkerställa ett stort antal insamlade celler. Trots den ökade enzymkoncentrationen erhölls fler levande celler än med hjälp av protokoll 1. Satellitceller uttrycker ett specifikt mön.......

Vi tackar Anastasia Bannwarth för utmärkt teknisk assistans. Vi tackar IGBMC:s djurhusanläggning, cellodlingen, Mouse Clinical Institute (ICS, Illkirch, Frankrike), avbildningen, elektronmikroskopin, flödescytometrin och GenomEast-plattformen, en medlem av konsortiet "France Génomique" (ANR-10-INBS-0009).

Detta arbete från det tvärvetenskapliga tematiska institutet IMCBio, som en del av ITI-programmet 2021-2028 vid Strasbourgs universitet, CNRS och Inserm, stöddes av IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) och av SFRI-STRAT'US-projektet (ANR 20-SFRI-0012) och EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) inom ramen för det franska programmet Investments for the Fu....