Ett effektivt protokoll för CUT&RUN-analys av FACS-isolerade mussatellitceller

Summary

Här presenteras ett effektivt protokoll för fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) isolering av muskelsatellitceller i musextremiteter anpassade för studier av transkriptionsreglering i muskelfibrer genom klyvning under mål och frisättning med hjälp av nukleas (CUT&RUN).

Abstract

Genomomfattande analyser med små cellpopulationer är ett stort hinder för studier, särskilt inom stamcellsområdet. Detta arbete beskriver ett effektivt protokoll för fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) isolering av satellitceller från extremitetsmuskeln, en vävnad med ett högt innehåll av strukturella proteiner. Dissekerade extremitetsmuskler från vuxna möss stördes mekaniskt genom malning i medium kompletterat med dispase och kollagenas typ I. Vid matsmältningen filtrerades homogenatet genom cellsilar och cellerna suspenderades i FACS-buffert. Viabiliteten bestämdes med fixerbar viabilitetsfläck och immunfärgade satellitceller isolerades med FACS. Celler lyserades med Triton X-100 och frigjorda kärnor bands till konanavalin A magnetiska pärlor. Kärn-/pärlkomplex inkuberades med antikroppar mot transkriptionsfaktorn eller histonmodifieringar av intresse. Efter tvätt inkuberades kärn-/pärlkomplex med protein A-mikrokocknukleas, och kromatinklyvning initierades med CaCl₂. Efter DNA-extraktion genererades och sekvenserades bibliotek, och profilerna för genomomfattande transkriptionsfaktorbindning och kovalenta histonmodifieringar erhölls genom bioinformatisk analys. De toppar som erhölls för de olika histonmarkeringarna visade att bindningshändelserna var specifika för satellitceller. Dessutom avslöjade känd motivanalys att transkriptionsfaktorn var bunden till kromatin via dess kognata responselement. Detta protokoll är därför anpassat för att studera genreglering i vuxna mösss muskelsatellitceller.

Introduction

Tvärstrimmiga skelettmuskler utgör i genomsnitt 40 % av vikten av den totala människokroppen¹. Muskelfibrer uppvisar en anmärkningsvärd förmåga till regenerering vid skada, vilket beskrivs av sammansmältningen av nybildade myocyter och genereringen av nya myofibrer som ersätter de skadade². År 1961 rapporterade Alexander Mauro en population av mononukleära celler som han kallade satellitceller³. Dessa stamceller uttrycker transkriptionsfaktorn parad box 7 (PAX7) och är belägna mellan den basala laminan och sarkolemma av muskelfibrer⁴. De rapporterades uttrycka kluster av di....

Protocol

Möss hölls i ett ackrediterat djurstall, i enlighet med nationella riktlinjer för djurvård (Europeiska kommissionens direktiv 86/609/EEG; Franskt dekret nr 87-848) om användning av försöksdjur för forskning. Planerade manipulationer lämnades in till den etiska kommittén (Com'Eth, Strasbourg, Frankrike) och till det franska forskningsministeriet (MESR) för etisk utvärdering och godkännande enligt 2010/63/EU-direktivet under APAFIS-nummer #22281.

1. Beredning av cellsuspension.......

Discussion

Den aktuella studien redovisar en standardiserad, tillförlitlig och lättanvänd metod för isolering och odling av mussatellitceller, samt bedömning av transkriptionsreglering med CUT&RUN-metoden.

Detta protokoll omfattar flera kritiska steg. Den första är muskelstörningar och fibersmältning för att säkerställa ett stort antal insamlade celler. Trots den ökade enzymkoncentrationen erhölls fler levande celler än med hjälp av protokoll 1. Satellitceller uttrycker ett specifikt mön.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microtube	Eppendorf	2080422
2 mL microtube	Star Lab	S1620-2700
5 mL tubes	CORNING-FALCON	352063
50 mL tubes	Falcon	352098
anti-AR	abcam	ab108341
anti-CD11b	eBioscience	25-0112-82
anti-CD31	eBioscience	12-0311-82
anti-CD34	eBioscience	48-0341-82
anti-CD45	eBioscience	12-0451-83
anti-CXCR4	eBioscience	17-9991-82
anti-DMD	abcam	ab15277
anti-H3K27ac	Active Motif	39133
anti-H3K4me2	Active Motif	39141
anti-ITGA7	MBL	k0046-4
anti-PAX7	DSHB	AB_528428
anti-TER119	BD Pharmingen TM	553673
Beads	Polysciences	86057-3	BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µm	Corning®	431752
Cell Strainer 40 µm	Corning®	431750
Cell Strainer 70 µm	Corning®	431751
Centrifuge 1	Eppendorf	521-0011	Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2	Eppendorf	5805000010	Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System	ThermoFischer	171080	Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agent	Sigma	SLBQ7780V	RNaseZAPTM
Collagenase, type I	Thermo Fisher	17100017	10 mg/mL
Dispase	STEMCELL technologies	7913	5 U/mL
DynaMag™-2 Aimant	Invitrogen	12321D
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	565388
Flow cytometer	BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer	23-14816-01
Fluoromount G with DAPI	Invitrogen	00-4959-52
Genome browser	IGV		http://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Hydrogel	Corning®	354277	Matrigel hESC qualified matrix
Image processing software	Image J®		V 1.8.0
Laboratory film	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	PARAFILM® M
Liberase LT	Roche	5401020001
Propyl gallate	Sigma-Aldrich	2370
Sequencer	Illumina Hiseq 4000	SY-401-4001
Shaking water bath	Bioblock Scientific polytest 20	18724