JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Developmental Biology

FACS ile İzole Edilmiş Fare Uydu Hücrelerinin CUT&RUN Analizi için Etkili Bir Protokol

Published: July 7th, 2023

DOI:

10.3791/65215

1CNRS, Inserm, IGBMC UMR 7104- UMR-S 1258, Université de Strasbourg
* These authors contributed equally

Burada sunulan, fare uzuv kas uydu hücrelerinin floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) izolasyonu için, hedeflerin altında bölünme ve nükleaz (CUT &RUN) kullanılarak salım yoluyla kas liflerinde transkripsiyon regülasyonu çalışmasına uyarlanmış etkili bir protokoldür.

Küçük hücre popülasyonları ile genom çapında analizler, özellikle kök hücre alanındaki çalışmalar için büyük bir kısıtlamadır. Bu çalışma, yüksek yapısal protein içeriğine sahip bir doku olan ekstremite kasından uydu hücrelerinin floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) izolasyonu için etkili bir protokolü açıklamaktadır. Yetişkin farelerden alınan disseke ekstremite kasları, dispas ve tip I kollajenaz ile takviye edilmiş besiyerinde kıyma ile mekanik olarak bozuldu. Sindirimden sonra, homojenat hücre süzgeçlerinden süzüldü ve hücreler FACS tamponunda süspanse edildi. Canlılık, sabitlenebilir canlılık boyası ile belirlendi ve immün boyalı uydu hücreleri FACS ile izole edildi. Hücreler Triton X-100 ile parçalandı ve serbest bırakılan çekirdekler konkanavalin A manyetik boncuklarına bağlandı. Çekirdek/boncuk kompleksleri, ilgilenilen transkripsiyon faktörüne veya histon modifikasyonlarına karşı antikorlarla inkübe edildi. Yıkamalardan sonra, çekirdek/boncuk kompleksleri protein A-mikrokok nükleazı ile inkübe edildi ve CaCl2 ile kromatin bölünmesi başlatıldı. DNA ekstraksiyonundan sonra, kütüphaneler oluşturuldu ve dizilendi ve genom çapında transkripsiyon faktörü bağlanması ve kovalent histon modifikasyonları için profiller biyoinformatik analiz ile elde edildi. Çeşitli histon işaretleri için elde edilen pikler, bağlanma olaylarının uydu hücrelerine özgü olduğunu gösterdi. Ayrıca, bilinen motif analizi, transkripsiyon faktörünün, aynı kökenli yanıt elemanı aracılığıyla kromatine bağlı olduğunu ortaya çıkardı. Bu nedenle bu protokol, yetişkin farelerde uzuv kas uydu hücrelerinde gen regülasyonunu incelemek için uyarlanmıştır.

İskelet çizgili kaslar, toplam insan vücudunun ağırlığının ortalama %40'ını temsil eder1. Kas lifleri, yeni oluşan miyositlerin füzyonu ve hasarlı olanların yerini alan yeni miyoliflerin üretilmesi ile tanımlanan yaralanma üzerine rejenerasyon için dikkate değer bir kapasite sergiler2. 1961'de Alexander Mauro, uydu hücreleri3 olarak adlandırdığı bir mononükleer hücre popülasyonu bildirdi. Bu kök hücreler, transkripsiyon faktörü eşleştirilmiş kutu 7'yi (PAX7) eksprese eder ve bazal lamina ile kas liflerininsarkolemması arasında bulunur 4. Farklılaşma kümesini 34 (CD34; hemat....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Fareler, Ulusal Hayvan Bakım Yönergelerine (Avrupa Komisyonu direktifi 86/609/CEE; Fransız kararnamesi no.87-848) laboratuvar hayvanlarının araştırma için kullanımına ilişkindir. Amaçlanan manipülasyonlar, 2010/63/EU direktifine göre etik değerlendirme ve yetkilendirme için Etik Komite'ye (Com'Eth, Strasbourg, Fransa) ve Fransız Araştırma Bakanlığı'na (MESR) APAFIS numarası #22281 altında sunulmuştur.

1. Floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) .......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Fare iskelet kaslarından uydu hücreleri, Gunther ve ark. (bundan sonra Protokol 1)12 ve Liu ve ark.23 (bundan sonra Protokol 2 olarak anılacaktır). Protokol 1'de önerilen kollajenaz ve dispas konsantrasyonu kullanılırken sindirimden sonra sindirilmemiş kas lifleri gözlendiğinden, adım 1.2.1 ve 1.2.3'te açıklandığı gibi kas lifi ayrışmasını iyileştirmek için enzim miktarı arttırılmıştır. Protokol 2'de belirtildiği gibi, numuneler hücre canlılı.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu çalışma, fare uydu hücrelerinin izolasyonu ve kültürü için standartlaştırılmış, güvenilir ve gerçekleştirmesi kolay bir yöntemin yanı sıra CUT & RUN yöntemi ile transkripsiyonel regülasyonun değerlendirilmesini bildirmektedir.

Bu protokol birkaç kritik adımı içerir. Birincisi, çok sayıda toplanan hücreyi sağlamak için kas bozulması ve lif sindirimidir. Artan enzim konsantrasyonuna rağmen, Protokol 1 kullanılandan daha fazla canlı hücre elde edildi. Uydu h.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mükemmel teknik yardım sağladığı için Anastasia Bannwarth'a teşekkür ederiz. IGBMC hayvan barınağı tesisine, hücre kültürüne, Fare Klinik Enstitüsü'ne (ICS, Illkirch, Fransa), görüntülemeye, elektron mikroskobuna, akış sitometrisine ve 'France Génomique' konsorsiyumunun (ANR-10-INBS-0009) bir üyesi olan GenomEast platformuna teşekkür ederiz.

Strazburg Üniversitesi, CNRS ve Inserm'in ITI 2021-2028 programının bir parçası olarak Disiplinlerarası Tematik Enstitüsü IMCBio'nun bu çalışması, Geleceğe Yönelik Fransız Yatırımları Programı çerçevesinde IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) ve SFRI-STRAT'US projesi (ANR 20-SFRI-0012) ve EUR IMCBio (ANR-17-....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microtubeEppendorf2080422
2 mL microtubeStar LabS1620-2700
5 mL tubesCORNING-FALCON352063
50 mL tubesFalcon352098
anti-ARabcamab108341
anti-CD11beBioscience25-0112-82
anti-CD31eBioscience12-0311-82
anti-CD34eBioscience48-0341-82
anti-CD45eBioscience12-0451-83
anti-CXCR4eBioscience17-9991-82
anti-DMDabcamab15277
anti-H3K27acActive Motif39133
anti-H3K4me2Active Motif39141
anti-ITGA7MBLk0046-4
anti-PAX7DSHBAB_528428
anti-TER119BD Pharmingen TM553673
BeadsPolysciences86057-3BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µmCorning® 431752
Cell Strainer 40 µmCorning® 431750
Cell Strainer 70 µmCorning® 431751
Centrifuge 1Eppendorf521-0011Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2Eppendorf5805000010Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System ThermoFischer171080Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agentSigma  SLBQ7780VRNaseZAPTM
Collagenase, type I Thermo Fisher1710001710 mg/mL
Dispase STEMCELL technologies79135 U/mL
DynaMag™-2 AimantInvitrogen12321D
Fixable Viability StainBD Biosciences565388
Flow cytometerBD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer23-14816-01
Fluoromount G with DAPIInvitrogen00-4959-52
Genome browser IGVhttp://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol Sigma-AldrichG9012
HydrogelCorning® 354277Matrigel hESC qualified matrix
Image processing softwareImage J®V 1.8.0
Laboratory filmSigma-AldrichP7793-1EAPARAFILM® M
Liberase LTRoche5401020001
Propyl gallateSigma-Aldrich2370
Sequencer Illumina Hiseq 4000SY-401-4001
Shaking water bathBioblock Scientific polytest 2018724

  1. Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
  2. Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).
  3. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
  4. Buckingham, M. Skeletal muscle progenitor cells and the role of Pax genes. Comptes Rendus Biologies. 330 (6-7), 530-533 (2007).
  5. Tosic, M., et al. Lsd1 regulates skeletal muscle regeneration and directs the fate of satellite cells. Nature Communications. 9 (1), 366 (2018).
  6. Kuang, S., Gillespie, M. A., Rudnicki, M. A. Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 2 (1), 22-31 (2008).
  7. Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
  8. Robinson, D. C. L., et al. Negative elongation factor regulates muscle progenitor expansion for efficient myofiber repair and stem cell pool repopulation. Developmental Cell. 56 (7), 1014-1029 (2021).
  9. Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
  10. Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).
  11. Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, (2019).
  12. Gunther, S., et al. Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).
  13. Donlin, L. T., et al. Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue. Arthritis Research & Therapy. 20 (1), 139 (2018).
  14. Rico, L. G., et al. Accurate identification of cell doublet profiles: Comparison of light scattering with fluorescence measurement techniques. Cytometry. Part A. 103 (3), 447-454 (2022).
  15. Schreiber, V., et al. Extensive NEUROG3 occupancy in the human pancreatic endocrine gene regulatory network. Molecular Metabolism. 53, 101313 (2021).
  16. Rovito, D., et al. Myod1 and GR coordinate myofiber-specific transcriptional enhancers. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4472-4492 (2021).
  17. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  18. Meers, M. P., Tenenbaum, D., Henikoff, S. Peak calling by Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN chromatin profiling. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 42 (2019).
  19. Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Research. 44, W160-W165 (2016).
  20. Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
  21. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  22. Zou, Z., Ohta, T., Miura, F., Oki, S. ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data. Nucleic Acids Research. 50, W175-W182 (2022).
  23. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  24. Brandhorst, H., et al. Successful human islet isolation utilizing recombinant collagenase. Diabetes. 52 (5), 1143-1146 (2003).
  25. Nikolic, D. M., et al. Comparative analysis of collagenase XI and liberase H1 for the isolation of human pancreatic islets. Hepatogastroenterology. 57 (104), 1573-1578 (2010).
  26. Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
  27. Diel, P., Baadners, D., Schlupmann, K., Velders, M., Schwarz, J. P. C2C12 myoblastoma cell differentiation and proliferation is stimulated by androgens and associated with a modulation of myostatin and Pax7 expression. Journal of Molecular Endocrinology. 40 (5), 231-241 (2008).
  28. Gronemeyer, H., Gustafsson, J. A., Laudet, V. Principles for modulation of the nuclear receptor superfamily. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (11), 950-964 (2004).
  29. Billas, I., Moras, D. Allosteric controls of nuclear receptor function in the regulation of transcription. Journal of Molecular Biology. 425 (13), 2317-2329 (2013).
  30. Garcia-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
  31. Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 6, 35 (2016).
  32. Schultz, E. A quantitative study of the satellite cell population in postnatal mouse lumbrical muscle. The Anatomical Record. 180 (4), 589-595 (1974).
  33. Hyder, A. Effect of the pancreatic digestion with liberase versus collagenase on the yield, function and viability of neonatal rat pancreatic islets. Cell Biology International. 29 (9), 831-834 (2005).
  34. Liang, F., et al. Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques. Journal of Immunological Methods. 425, 69-78 (2015).
  35. Park, J. Y., Chung, H., Choi, Y., Park, J. H. Phenotype and tissue residency of lymphocytes in the murine oral mucosa. Frontiers in Immunology. 8, 250 (2017).
  36. Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).

Tags

CUT RUN Analizi
FACS zoleli Fare Uydu H creleri
K k H cre Alan
K k H cre Pop lasyonlar
Verimli Protokol
Floresanla Aktive Edilen H cre S ralama
Uzuv Kas
Yap sal Proteinler
K yma
Ortam
Dispas
Tip I Kollajenaz
H cre S zge leri
FACS Tamponu
Canl l k Boyas
mm n Lekeli Uydu H creleri
Triton X 100
Concanavalin A Manyetik Boncuklar
Transkripsiyon Fakt r
Histon Modifikasyonlar
Protein A mikrokok N kleaz
Kromatin B l nmesi
CaCl2
DNA Ekstraksiyonu
K t phaneler
Biyoinformatik Analiz

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved