Caracterização de Transportadores de Zinco em Mamíferos Utilizando um Ensaio de Transporte de Zinco In Vitro

Metais de transição como íons Zn²⁺ devem ser fortemente regulados devido à sua toxicidade celular. Anteriormente, a atividade dos transportadores de Zn 2+ era medida indiretamente, determinando-se o nível de expressão do transportador sob diferentes concentrações de Zn²⁺. Isso foi feito utilizando imunohistoquímica, medindo o RNAm no tecido ou determinando os níveis celulares de Zn²⁺. Com o desenvolvimento dos sensores intracelulares de Zn 2+, as atividades dos transportadores de zinco são atualmente determinadas principalmente pela correlação de alterações no Zn 2+ intracelular, detectadas usando sondas fluorescentes, com a expressão dos transportadores de Zn²⁺. No entanto, ainda hoje, apenas alguns laboratórios monitoram mudanças dinâmicas no Zn²⁺ intracelular e o utilizam para medir a atividade de transportadores de zinco diretamente. Parte do problema é que dos 10 transportadores de zinco da família ZnT, com exceção do ZnT10 (transporta manganês), apenas o transportador de zinco 1 (ZnT1) está localizado na membrana plasmática. Portanto, relacionar a atividade de transporte a mudanças na concentração intracelular de Zn²⁺ é difícil. Este artigo descreve uma maneira direta de determinar a cinética de transporte de zinco usando um ensaio baseado em um corante fluorescente específico de zinco, FluoZin-3. Este corante é carregado em células de mamíferos em sua forma de éster e, em seguida, aprisionado no citosol devido à atividade celular de di-esterase. As células são carregadas com Zn 2+ utilizando a piritionato ionóforo Zn²⁺. A atividade do ZnT1 é avaliada a partir da parte linear da redução da fluorescência após o washout celular. A fluorescência medida em uma excitação de 470 nm e emissão de 520 nm é proporcional ao Zn²⁺ intracelular livre. A seleção das células que expressam ZnT1 marcadas com o fluoróforo mCherry permite monitorar apenas as células que expressam o transportador. Este ensaio é usado para investigar a contribuição de diferentes domínios da proteína ZnT1 para o mecanismo de transporte de ZnT1 humano, uma proteína transmembrana eucariótica que extrai o excesso de zinco da célula.