Presentato qui è un protocollo per l'imaging in vivo dell'intero cervello del pesce zebra larvale utilizzando la microscopia a fluorescenza tridimensionale. La procedura sperimentale include la preparazione del campione, l'acquisizione di immagini e la visualizzazione.
Come animale modello di vertebrato, i pesci zebra larvali sono ampiamente utilizzati nelle neuroscienze e offrono un'opportunità unica per monitorare l'attività dell'intero cervello alla risoluzione cellulare. Qui, forniamo un protocollo ottimizzato per l'esecuzione dell'imaging dell'intero cervello del pesce zebra larvale utilizzando la microscopia a fluorescenza tridimensionale, compresa la preparazione e l'immobilizzazione del campione, l'incorporamento del campione, l'acquisizione di immagini e la visualizzazione dopo l'imaging. L'attuale protocollo consente l'imaging in vivo della struttura e dell'attività neuronale di un cervello larvale di zebrafish a una risoluzione cellulare per oltre 1 ora utilizzando la microscopia confocale e la microscopia a fluorescenza progettata su misura. Vengono anche discussi i passaggi critici del protocollo, tra cui il montaggio e il posizionamento del campione, la prevenzione della formazione di bolle e polvere nel gel di agarosio e l'evitare il movimento nelle immagini causato dalla solidificazione incompleta del gel di agarosio e dalla paralisi del pesce. Il protocollo è stato convalidato e confermato in più impostazioni. Questo protocollo può essere facilmente adattato per l'imaging di altri organi di un pesce zebra larvale.
Il pesce zebra (Danio rerio) è stato ampiamente adottato come animale vertebrato modello nelle neuroscienze, grazie alla sua trasparenza ottica allo stadio larvale, al suo rapido sviluppo, al suo basso costo di manutenzione e alla disponibilità di diversi strumenti genetici 1,2,3,4. In particolare, la trasparenza ottica delle larve combinata con i reporter fluorescenti geneticamente codificati di eventi biologici 5,6,7,8,9 offre un'opportunità unica per visualizzare sia l'attività neuronale che la struttura a livello dell'intero cervello 10,11,12,13,14 . Tuttavia, anche con un microscopio che supporta la risoluzione cellulare, le immagini acquisite non conservano necessariamente le informazioni a livello di singola cellula; La qualità ottica dell'immagine può essere degradata a causa dell'aberrazione introdotta dal gel di agarosio utilizzato per il montaggio del campione, il pesce può essere montato ad angolo, quindi le regioni di interesse non sono completamente contenute all'interno del campo visivo del microscopio e il pesce può muoversi durante la registrazione, causando artefatti di movimento nelle immagini o impedendo un'accurata estrazione del segnale dalle immagini.
Pertanto, è necessario un protocollo efficace e riproducibile per acquisire dati di immagine di alta qualità con rumore e movimento minimi. Sfortunatamente, i protocolli pubblicamente disponibili per l'imaging di un intero cervello di pesce zebra larvale in vivo 15,16,17,18,19 descrivono solo brevemente la procedura, lasciando parti sostanziali dei dettagli, come la solidificazione dell'agarosio, le tecniche di montaggio precise e il posizionamento del campione usando una pinza, a ciascun sperimentatore. Inoltre, le incongruenze nei metodi di concentrazione e immobilizzazione dell'agarosio 10,11,14,15,16,17,18,19 possono portare a sfide derivanti dal movimento dei pesci durante il processo di imaging.
Qui viene fornito un protocollo dettagliato per l'imaging dell'intero cervello del pesce zebra larvale utilizzando la microscopia a fluorescenza tridimensionale. La Figura 1 fornisce una panoramica grafica del protocollo: preparazione e immobilizzazione del campione, incorporamento dei campioni, acquisizione delle immagini e visualizzazione dopo l'imaging. L'imaging strutturale e funzionale del cervello larvale del pesce zebra in vivo è dimostrato utilizzando un microscopio confocale commerciale e un microscopio a fluorescenza progettato su misura. Questo protocollo può essere adattato dai professionisti per l'imaging cerebrale con determinati stimoli sensoriali o contesti comportamentali a seconda delle esigenze sperimentali e del design.
Tutti gli esperimenti sul pesce zebra sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del KAIST (KA2021-125). Un totale di 12 pesci zebra adulti con espressione pan-neuronale dell'indicatore di calcio GCaMP7a [Tg(huc:GAL4); Tg(UAS:GCaMP7a)] su uno sfondo casper [mitfa(w2/w2);mpv17(a9/a9)] sono stati utilizzati per la riproduzione. Questo gruppo era composto da otto femmine e quattro maschi, con età variabili da 3 a 12 mesi. Gli esperimenti di imaging sono stati eseguiti su pesci zebra larvali a 3-4 giorni dopo la fecondazione (d.p.f.), una fase durante la quale il loro sesso non può essere determinato.
1. Preparazione del campione di zebrafish
2. 2% (wt/vol) preparazione gel di agarosio
3. Montaggio e posizionamento del campione
4. Acquisizione di immagini
5. Configurazione per le visualizzazioni utilizzando napari
NOTA: napari è un visualizzatore di immagini multidimensionale open source in un ambiente Python con rendering basato su unità di elaborazione grafica (GPU)33. Il plugin napari-animation fornisce una creazione programmatica di filmati. L'utilizzo di Fiji, un programma di elaborazione delle immagini open source, è consigliato per l'elaborazione di immagini generiche, come il filtraggio e la trasformazione geometrica (vedere Tabella dei materiali). Il codice sorgente usato per la visualizzazione tramite napari è disponibile su GitHub (https://github.com/NICALab/Zebrafish-brain-visualization).
6. Visualizzare le strutture usando napari
7. Elaborazione delle immagini e visualizzazione dell'attività neuronale utilizzando napari
NOTA: Per visualizzare le immagini della serie temporale dell'attività neuronale come immagini sovrapposte di uno sfondo statico e di un'attività, è necessario applicare un algoritmo di decomposizione alle immagini grezze. Utilizzare un'implementazione MATLAB di un algoritmo di scomposizione chiamato BEAR24. La versione MATLAB di BEAR è disponibile su GitHub (https://github.com/NICALab/BEAR).
La struttura e l'attività neuronale del cervello larvale del pesce zebra che esprime l'indicatore di calcio pan-neuronale GCaMP7a (Tg(huc:GAL4); Tg(UAS:GCaMP7a))20,21,22 con un casper (mitfa(w2/w2);mpv17(a9/a9))34 lo sfondo è stato ripreso a 3-4 d.p.f. seguendo il protocollo descritto.
Per l'imaging strutturale volumetrico, il campione è stato ripreso utilizzando un sistema di microscopia confocale a scansione puntiforme commerciale dotato di un obiettivo a immersione d'acqua 16x 0,8 NA. Un laser di eccitazione a 488 nm è stato utilizzato sia per l'imaging strutturale che funzionale. La frequenza dei fotogrammi, la risoluzione dell'immagine, la dimensione dei pixel e la dimensione del passo assiale erano rispettivamente 0,25 Hz, 2048 x 2048, 0,34 μm e 1,225 μm. L'acquisizione dell'immagine è durata circa 1 ora e 20 minuti. Il campo visivo volumetrico dell'immagine acquisita copriva le regioni cerebrali del proencefalo, del mesencefalo e del retrosencefalo (Figura 4A). I corpi cellulari neuronali del midollo allungato, della piastra cerebellare, del tectum ottico, dell'abenula, e del telencefalo dorsale nell'intero cervello di 4 pesci zebra larvali d.p.f. erano chiaramente visibili nelle immagini di microscopia confocale (Figura 4B). Il rendering 3D delle immagini al microscopio confocale è stato eseguito utilizzando napari27 seguendo il suddetto protocollo (Figura 4C e Video 1).
Per l'imaging funzionale in 2-D, il campione è stato ripreso utilizzando lo stesso sistema di microscopia confocale, dotato di un obiettivo a immersione d'acqua 16x 0,8 NA. La frequenza dei fotogrammi, la risoluzione dell'immagine e la dimensione dei pixel erano rispettivamente di 2 Hz, 512 x 256 e 1,5 μm. I corpi delle cellule neuronali erano chiaramente visibili sia sullo sfondo che nell'attività neuronale sovrapposta (Figura 5A,B).
Per l'imaging funzionale 3D, è stato utilizzato un sistema di microscopia 3D progettato su misura18 , in grado di visualizzare in vivo l'attività neuronale di un intero cervello larvale di zebrafish con un campo visivo di 1.040 μm × 400 μm × 235 μm e risoluzioni laterali e assiali di 1,7 μm e 5,4 μm, rispettivamente. La velocità di imaging era fino a 4,2 volumi al secondo. Analogamente al rendering dei dati di imaging strutturale, napari è stato utilizzato per il rendering 3D dei dati di imaging del calcio dell'intero cervello (Figura 5C e Video 2).
Figura 1: Panoramica della procedura sperimentale. Preparazione e paralisi del campione di zebrafish (fase 1). La preparazione del gel di agarosio al 2% (wt/vol) (fase 2). Montaggio e posizionamento del campione (fase 3). Acquisizione di immagini (fase 4). Elaborazione delle immagini e visualizzazione della struttura e dell'attività neuronale (fase 5-7). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Procedura sperimentale per la preparazione dell'imaging dell'intero cervello . (A) Campione di zebrafish sottoposto a screening che esprime GCaMP7a pan-neuronale in una capsula di Petri riempita con acqua d'uovo. (B) Attrezzature e materiali necessari per il montaggio e il posizionamento del campione. (1) blocco termico a 37 °C; (2) 2% (wt/vol) gel di agarosio; (3) provetta da microcentrifuga da 1,5 ml; (4) acqua d'uovo; (5) 0,25 mg/mL di soluzione di bromuro di pancuronio; (6) Capsula di Petri; (7) pinze; (8) Pipetta di trasferimento. (C) Immagine stereomicroscopica del campione paralizzato. La freccia nera indica il cuore del campione. D) Il campione nella provetta da microcentrifuga da 1,5 mL viene trasferito mediante una pipetta. L'inserto mostra una vista ingrandita dell'area riquadro. (E) Il campione (freccia nera) viene posto al centro della piastra di Petri usando una pinza. (F) Il campione è allineato con una pinza. (G) Un esempio di campione incorporato disallineato. (H) Un esempio di campione incorporato allineato. (I) Il campione viene posto su un palcoscenico al microscopio sotto la lente dell'obiettivo per l'acquisizione delle immagini. Barra scala: 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Visualizzazione delle immagini cerebrali del pesce zebra larvale. (A) Il rendering 3D di un'immagine al microscopio confocale di un cervello larvale di zebrafish (4 d.p.f.) che esprime GCaMP7a pan-neuronale. napari, un visualizzatore di immagini multidimensionale open source in un ambiente Python, è stato utilizzato per il rendering. La finestra napari comprende controlli layer (riquadro rosso), un elenco di livelli (riquadro giallo), un canvas (riquadro blu) e una procedura guidata di animazione (riquadro verde). (B) I fotogrammi chiave con più impostazioni del visualizzatore vengono aggiunti per il rendering di un'animazione. (C) Immagine al microscopio confocale dell'imaging time-lapse 2D dell'attività neuronale nel cervello del pesce zebra larvale. L'immagine viene scomposta sullo sfondo (a sinistra) e l'attività neuronale (al centro), quindi sovrapposta (a destra). Barra scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Struttura di imaging del cervello di un pesce zebra larvale. (A) Proiezione della massima intensità (MIP) di un'immagine al microscopio confocale di un cervello larvale di zebrafish (4 d.p.f.) che esprime GCaMP7a pan-neuronale. Parte superiore: MIP laterale. In basso: MIP assiale. Ogni confine contiene il proencefalo (rosso), il mesencefalo (giallo) e il cervello posteriore (blu). (B) Un totale di 10 fette assiali a più profondità da un'immagine volumetrica del cervello (a z = 25 μm, 50 μm, 75 μm, 100 μm, 125 μm, 150 μm, 175 μm, 200 μm, 225 μm, 250 μm, contate verso l'alto dall'alto verso il basso; z = 0 μm indica la superficie superiore del cervello). Ogni scatola bianca rappresenta la regione del cervello (midollo allungato, piastra cerebellare, tectum ottico, abenula, telencefalo dorsale). (C) L'intero cervello reso usando napari. Barra scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Imaging dell'attività neuronale di un cervello larvale di zebrafish. (A) Immagine al microscopio confocale dell'attività neuronale in un cervello larvale di zebrafish (4 d.p.f.) che esprime GCaMP7a pan-neuronale. Barra della scala: 100 μm. (B) Vista ingrandita dell'area riposta in A che mostra l'attività neuronale nel tectum ottico in più punti temporali. Barra della scala: 20 μm. (C) Il rendering 3D dell'attività neuronale dell'intero cervello nel cervello del pesce zebra larvale acquisito utilizzando un microscopio progettato su misura (sinistra: t = 133 s; destra: t = 901 s). L'attività neuronale è sovrapposta allo sfondo statico. Barra scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Imaging time-lapse con e senza deriva del campione. (A) Imaging time-lapse del cervello larvale del pesce zebra che esprime GCaMP7a pan-neuronale con deriva del campione. L'acqua dell'uovo è stata aggiunta al campione prima della solidificazione del gel di agarosio (fase 3.6-3.7). Il pesce si muoveva nelle direzioni laterale e assiale. (B) Imaging time-lapse di un cervello larvale di zebrafish senza deriva del campione. L'acqua dell'uovo è stata aggiunta al campione dopo la solidificazione del gel di agarosio (fase 3.6-3.7). Barra scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Video 1: Rendering 3D dell'intera struttura cerebrale di un pesce zebra larvale (4 d.p.f.) cerebrale che esprime GCaMP7a pan-neuronale. Clicca qui per scaricare questo video.
Video 2: Rendering 3D dell'attività neuronale dell'intero cervello in un cervello larvale zebrafish (4 d.p.f.) che esprime GCaMP7a pan-neuronale. Clicca qui per scaricare questo video.
L'attuale protocollo consente l'imaging in vivo dell'intero cervello del pesce zebra larvale per un periodo prolungato (ad esempio, più di 1 ora) e la visualizzazione dei dati di imaging strutturale e funzionale acquisiti.
I passaggi più critici sono il montaggio e il posizionamento del campione. Durante l'incorporazione del campione, è fondamentale prevenire la formazione di bolle ed evitare la polvere nel gel di agarosio. Se il gel contiene bolle d'aria e polvere, la qualità dell'immagine potrebbe essere gravemente degradata. Durante il posizionamento del campione mediante una pinza, è importante assicurarsi che il campione sia livellato sia orizzontalmente che verticalmente. In caso contrario, le regioni di interesse potrebbero non essere contenute nel campo visivo del microscopio. Inoltre, questo posizionamento dovrebbe essere fatto entro una breve finestra temporale prima della solidificazione del gel di agarosio per evitare di causare danni alla sua superficie, in quanto tali danni compromettono la qualità dell'immagine.
Un'altra grande sfida è evitare il movimento nelle immagini che provengono dalla solidificazione incompleta del gel di agarosio (Figura 6) e dalla paralisi del pesce zebra. Quando l'acqua dell'uovo viene aggiunta al campione prima della completa solidificazione del gel agorse, i pesci si muovono lentamente sia lateralmente che assialmente, manifestandosi come deriva del campione nelle immagini della serie temporale (Figura 6A). Se la dose di paralitici è insufficiente o la durata dell'effetto termina, il campione può tentare di muoversi, il che appare come contrazione rapida nelle immagini time-lapse.
Nonostante l'importanza dei suddetti passaggi per l'acquisizione di immagini di alta qualità senza artefatti di movimento, i protocolli 15,16,17,18,19 disponibili al pubblico forniscono solo una breve panoramica della procedura sperimentale, mancando di questi dettagli. Ad esempio, le immagini acquisite senza protocolli di immobilizzazione11 soffrono di sostanziali artefatti di movimento che rendono difficile l'analisi dell'immagine a valle. Integrando componenti essenziali, come la solidificazione del gel di agarosio e la paralisi del campione, il nostro protocollo migliora significativamente la coerenza nella qualità delle immagini acquisite, riducendo al minimo gli artefatti di movimento.
In sintesi, viene descritta una procedura sperimentale ottimizzata e riproducibile per l'imaging in vivo del cervello del pesce zebra larvale. La validità e la riproducibilità di questo protocollo per l'imaging in vivo dell'attività e della struttura cerebrale sono state confermate in contesti multipli 14,18,29,30,31. Il presente flusso di lavoro si è concentrato sull'imaging dell'intero cervello del pesce zebra larvale, ma può essere facilmente applicato all'imaging di altri organi del pesce zebra larvale35,36.
Le linee di zebrafish utilizzate per l'imaging del calcio sono state fornite dal Zebrafish Center for Disease Modeling (ZCDM), Corea. Questa ricerca è stata sostenuta dalla National Research Foundation of Korea (2020R1C1C1009869, NRF2021R1A4A102159411, RS-2023-00209473).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL microcentrifuge tube | SciLab | SL.Tub3513 | To aliquot agarose gel and pancuronium bromide solution |
15 mL Falcon tubes | Falcon | 352096 | To prepare agarose gel and pancuronium bromide solution |
16× 0.8NA water dipping objective lens | Nikon | CFI75 LWD 16×W | Objective lens for whole-brain imaging |
1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-10G | 200 μM of 1-phenyl 2-thiourea (PTU) |
50 mL Falcon tubes | Falcon | 352070 | To prepare egg water |
Disposable transfer pipette | SciLab | SL.Pip3032 | To transfer zebrafish larvae |
Egg water | N/A | N/A | 0.6 g sea salt in 10 L deionized water |
Forceps | Karl Hammacher GmbH | HSO 010-10 | Forceps used for sample positioning |
Low melting point agarose | Thermo Scientific | R0801 | 2% (wt/vol) agarose gel |
Napari | Napari | N/A | To visualize microscopy images in 3-D |
NIS-Elements C | Nikon | N/A | Imaging software for confocal microscope |
Pancuronium bromide | Sigma-Aldrich | P1918-10MG | 0.25 mg/mL of pancuronium bromide solution |
Petri dish, 35 mm | SPL Life Sciences | 11035 | Petri dish used for sample embedding |
Petri dish, 55 mm | SPL Life Sciences | 11050 | To prepare zebrafish larvae after screening |
Point-scanning confocal microscopy system (C2 Plus) | Nikon | N/A | Confocal microscope for whole-brain imaging |
Sea salt | Sigma-Aldrich | S9883-500G | Sea salt used for preparing egg water |
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