В данной статье описан протокол ручного усиления тирамидного сигнала (TSA) мультиплексной иммунофлуоресценции (mIF) в сочетании с анализом изображений и пространственным анализом. Этот протокол может быть использован с фиксированными формалином парафиновыми срезами (FFPE) для окрашивания от двух до шести антигенов на предметное стекло в зависимости от сканера предметного стекла, доступного в лаборатории.
Микроокружение опухоли (TME) состоит из множества различных типов клеток, таких как цитотоксические иммунные клетки и иммуномодулирующие клетки. В зависимости от своего состава и взаимодействия между раковыми клетками и периопухолевыми клетками, TME может влиять на прогрессирование рака. Характеристика опухолей и их сложного микроокружения может улучшить понимание раковых заболеваний и может помочь ученым и клиницистам открыть новые биомаркеры.
Недавно мы разработали несколько мультиплексных панелей иммунофлуоресценции (mIF) на основе амплификации тирамидного сигнала (TSA) для характеристики TME при колоректальном раке, плоскоклеточном раке головы и шеи, меланоме и раке легких. После завершения окрашивания и сканирования соответствующих панелей образцы анализируются с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Пространственное положение и окрашивание каждой клетки затем экспортируются из этого программного обеспечения для количественной оценки в R. Мы разработали R-скрипты, которые позволяют нам не только анализировать плотность каждого типа клеток в нескольких опухолевых компартментах (например, в центре опухоли, крае опухоли и строме), но и выполнять анализ на расстоянии между различными типами клеток.
Этот конкретный рабочий процесс добавляет пространственное измерение к классическому анализу плотности, который уже обычно выполняется для нескольких маркеров. Анализ mIF может позволить ученым лучше понять сложное взаимодействие между раковыми клетками и TME и обнаружить новые прогностические биомаркеры ответа на лечение, такие как ингибиторы иммунных контрольных точек и таргетная терапия.
С развитием таргетной терапии и ингибиторов иммунных контрольных точек стало крайне важно лучше охарактеризовать взаимодействие между раковыми клетками и их опухолевым микроокружением, и в настоящее время это важная область трансляционных исследований. TME состоит из множества различных типов клеток с балансом иммунных цитотоксических клеток, нацеленных на раковые клетки, и иммуномодулирующих клеток, которые могут способствовать росту опухоли и инвазивности 1,2,3,4. Характеристика этой сложной среды может улучшить понимание раковых заболеваний и может помочь ученым и клиницистам открыть новые прогностические и прогностические биомаркеры, чтобы лучше отбирать пациентов для будущего лечения 5,6. Например, Галон и его команда разработали Immunoscore, который представляет собой воспроизводимый метод оценки, который можно использовать в качестве прогностического биомаркера. Immunoscore рассчитывается с использованием плотности CD3+ и CD8+ Т-клеток в инвазивном крае и в центре опухоли 7,8.
За последние десятилетия были разработаны коммерческие решения для mIF, но они часто являются дорогостоящими и предназначены для специфических панелей антигенов. Чтобы преодолеть потребность в специфических панелях антигенов в академических и трансляционных исследованиях, мы разработали экономически эффективный метод выполнения mIF на срезах опухоли FFPE, позволяющий окрашивать от двух до шести антигенов, добавленных к контрокрашиванию ядер клеток на образцах человека и мыши.
После того, как целые срезы ткани окрашены и отсканированы с помощью флуоресцентного слайд-сканера, образцы могут быть проанализированы с помощью нескольких программ для анализа изображений, поддерживающих большие пирамидальные наборы данных. Наконец, необработанные данные могут быть использованы в среде для статистических вычислений и графики, такой как программное обеспечение R (v.4.0.2), для выполнения плотности и пространственного анализа.
В этой рукописи представлен протокол, оптимизированный для окрашивания пятью маркерами, а также приемы и советы по оптимизации новых панелей. Кроме того, подробно описаны этапы анализа изображений и функции R, используемые для статистического и пространственного анализа.
Все образцы, использованные в настоящем протоколе, были получены в результате исследования, одобренного местными комитетами по этике и санкционированного компетентным органом. Все участники исследования дали письменное информированное согласие. Исследование зарегистрировано в ClinicalTrials.gov (NCT03608046).
1. Мультиплексная иммунофлюоресценция
2. Сканирование слайдов
3. Анализ изображений
4. Биоинформатика с использованием R
ПРИМЕЧАНИЕ: Скрипт R, предоставляющий более подробную информацию о следующих шагах, доступен на GitHub (benidovskaya/Ring: Pipeline for analysis of multiplex immunofluorescence stainings. [github.com])
Следуя этому протоколу, следует изучить несколько параметров, чтобы убедиться, что ткань правильно окрашена. Во-первых, окрашивание TSA должно отображать хороший динамический диапазон при использовании низкого времени экспозиции (обычно 2-100 мс) в процессе сканирования. Низкое время экспозиции означает, что амплификация была выполнена правильно во время реакции с HRP. Для антигенов, окрашенных вторичным антителом, непосредственно связанным с флуорохромом, время воздействия может быть намного больше, что может привести к фотообесцвечиванию (снижению интенсивности сигнала из-за длительного времени экспозиции). Во-вторых, важно убедиться, что каждое окрашивание показывает высокое отношение сигнал/шум. Высокий фоновый сигнал с низким сигналом антигена может быть признаком того, что первичное антитело недостаточно специфично, что эндогенные пероксидазы не были инактивированы правильно или что один шаг протокола не был выполнен адекватно. В-третьих, в зависимости от сканера слайдов и наборов фильтров, используемых для сканирования, можно увидеть перекрытия между двумя цветами (например, AF555, AF594 и AF647). Выбор правильных наборов фильтров на сканере и правильное разведение первичных антител имеют решающее значение для предотвращения возможных перекрестных обнаружений. Контроль качества заключается в обнаружении единичных окрашенных ячеек для каждого маркера в отсканированном файле. Наконец, также важно добавить положительный и отрицательный контроль для каждой партии окрашивания. Для иммунных клеток миндалины являются хорошим положительным контролем. Репрезентативный результат оптимального окрашивания показан на рисунке 1.
Рисунок 1: Местнораспространенный рак прямой кишки, окрашенный мультиплексной иммунофлуоресценцией. Сокращения: PD-1 = белок запрограммированной клеточной смерти 1; PD-L1 = запрограммированный лиганд смерти 1; ROR-γ = гамма-рецептор сирот, связанный с RAR; CD3 = кластер дифференциации 3; hPanCK = пан-цитокератин человека. Каждое окрашивание антигена сканируется в оттенках серого, а цвета, представленные на рисунке, являются псевдоцветами. Масштабная линейка с малым увеличением: 200 мкм; Масштабная линейка с большим увеличением: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Обнаружение ядер и окрашивания местно-распространенного рака прямой кишки с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Если параметр полноты не установлен правильно, программа обнаруживает две ячейки CD8+ (зеленый кружок), потому что они расположены близко друг к другу, но окрашивается только одна ячейка. Использование 70% полноты помогает избежать этого ложного срабатывания. Зеленый = hPanCK; желтый = CD3; Оранжевый = CD8. Масштабная линейка: 100 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Анализ изображений и восстановление метастазов колоректального рака печени на точечной диаграмме. На мультиплексном окрашивании (слева) панцитокератин человека окрашен в желтый цвет, CD3 — в зеленый, CD8 — в светло-голубой, а IDO — в оранжевый. На точечном графике (справа) клетки пан-цитокератина+ человека выделены желтым цветом, клетки CD3+CD8- зеленым, клетки CD3+CD8+ - синим, а клетки IDO+ - оранжевым. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Анализ хирургического участка HNSCC. (A) Хирургического участка HNSCC. Раковые клетки видны зеленым цветом. Вокруг опухолевых островков визуализируются периопухолевые клетки (CD3 желтого цвета и CD8 фиолетового цвета). (B) Центр опухоли (желтый цвет с черной каймой) вычисляется биоинформационно с помощью алгоритма k-ближайшего соседа на основе расстояния между опухолевыми островками от одной области. Вокруг этой области вычисляется инвазивный край (светло-желтый с серой каймой) на произвольной основе 500 мкм. (C) Инвазивные Т-клетки выделены черными точками в центре опухоли и серыми точками в инвазивном крае. Другие Т-клетки выделены светло-зелеными точками. Масштабная линейка: 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Тепловая карта плотности различных типов клеток местно-распространенной биопсии рака прямой кишки. Тепловая карта была построена с использованием неконтролируемой кластеризации плотностей различных типов ячеек из разных мультиплексных панелей с помощью пакета ComplexHeatmap. Для нормализации использовались масштабирование и центрирование. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Расстояния от клеток CD4+ и CD8+ до каждой IDO+ или опухолевой клетки. Клетки панцитокератина+ человека выделены желтым цветом, клетки CD3 + CD8- зеленым, клетки CD3 + CD8 + - синим, а клетки IDO + - оранжевым. (A) Самое близкое расстояние между опухолевыми клетками и каждой CD8+ Т-клеткой. (B) Штрих-графики расстояний между клетками IDO+ и каждой CD8+ Т-клеткой (синий) или CD4+ Т-клеткой (зеленый). (C) Пример выборки, проанализированной с помощью функции G-креста. Ось Y показывает вероятность того, что опухолевая клетка столкнется с лимфоцитом CD3+ в радиусе от 0 до 200 мкм вокруг опухолевой клетки. Показаны три кривые; теоретическая кривая обозначена пунктирным зеленым цветом (распределение Пуассона), скорректированная эмпирическая кривая с поправкой км - черным, а скорректированная эмпирическая кривая с коррекцией границ - пунктирным красным. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Иллюстрация квадратного счета. Вычисление границ и квадратный подсчет были выполнены с помощью пакета spatstats. Наиболее инфильтрированные квадраты (горячие точки) можно использовать для последующей статистики. CD4 окрашен в зеленый цвет, CD8 - в красный, а опухолевые клетки - в желтый. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Разведение антител и оптимизация извлечения антигена. Хромогенное обнаружение PD-1 с использованием трех различных разведений и двух различных растворов для извлечения антигена первичного антитела (цитрат pH 6 и EDTA pH 9). Масштабная линейка: 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Первичные антитела | Разбавление | Извлечение антигена | Вторичные антитела | Флуорохром | Позиция |
ПД-1 | 1/100 | ЭДТА (рН 9) | Антикролик | АФ647 | 1 |
ПД-Л1 | 1/1000 | ЭДТА (рН 9) | Антикролик | АФ488 | 2 |
РОР-γ | 1/200 | ЭДТА (рН 9) | Анти-мышь | АТТ0-425 | 3 |
СД3 | 1/100 | Цитрат (рН 6) | Антикролик | АФ555 | 4 |
hPanCK | 1/50 | Цитрат (рН 6) | Защита от мыши в сочетании с AF750 | 5 |
Таблица 1: Пример оптимизированной мультиплексной панели. Сокращения: PD-1 = белок запрограммированной клеточной смерти 1; PD-L1 = запрограммированный лиганд смерти 1; ROR-γ = гамма-рецептор сирот, связанный с RAR; CD3 = кластер дифференциации 3; hPanCK = пан-цитокератин человека; AF = AlexaFluor; ЭДТА = этилендиаминтетрауксусная кислота. CD3 используется для обнаружения Т-лимфоцитов; PD-1 используется для обнаружения истощенных лимфоцитов; ROR-γ используется для обнаружения Th-17; и hPanCK используется для обнаружения опухолевых клеток. В столбце позиции указывается порядок, в котором должен быть выполнен последовательный мультиплекс.
Наиболее важными параметрами, которые следует учитывать для оптимизации мультиплексного окрашивания, являются разведение, специфичность и извлечение антигена, используемые для каждого первичного антитела. Перед началом мультиплексного протокола необходимо проверить оптимальное разведение каждого первичного антитела и оптимальное извлечение эпитопа (рН 6 или рН 9) с помощью хромогенного окрашивания (DAB). Мы советуем тестировать три разведения для каждого буфера извлечения антигена: разведение, которое обычно указывается брендом, коммерциализирующим антитело, то же разведение, деленное в два раза, и то же разведение, умноженное в два раза (рис. 8). Выбор правильного разведения является очень важным шагом для проверки специфичности антител и оптимизации отношения сигнал/шум (SNR) окрашивания. После выбора правильного разведения в DAB одно и то же разведение следует протестировать для каждого первичного антитела с использованием униплексного TSA. После того, как буфер разведения и извлечения эпитопа выбран для каждого окрашивания антигена, также важно правильно настроить последовательность мультиплекса; В частности, некоторые антигены лучше окрашиваются в первой позиции, а другие - в последней. Мы советуем протестировать мультиплексную маркировку, используя все возможные перестановки порядка, чтобы выбрать, какое окрашивание антигена должно быть первым, вторым и т. Д. Это также очень важный шаг, потому что некоторые хрупкие антигены могут разлагаться после нескольких раундов поиска эпитопов, а некоторые антигены лучше окрашиваются после нескольких раундов поиска эпитопов. Например, SNR всегда выше в последней позиции для CD3 и в первой позиции для окрашивания PD-1. Кроме того, окрашиванию нескольких совместно локализованных антигенов может препятствовать зонтичный эффект (насыщение тирамидных реакционноспособных сайтов). Это можно ослабить, уменьшив концентрацию тирамида. Когда экспрессия одного антигена обусловлена экспрессией другого (CD8 присутствует только на CD3-экспрессирующих Т-клетках), мы рекомендуем окрашивать антиген с самой широкой экспрессией (в данном случае CD3) после другого. Наконец, выбор правильного флуорохрома для каждого окрашивания антигена в соответствии со спецификой сканера также является важным шагом, позволяющим избежать перекрестного обнаружения.
Основными преимуществами этого метода являются усиление и полученное соотношение сигнал/шум. Однако этот метод имеет ограничение, которое заключается в том, что окрашивание происходит последовательно, а флуорохромы ковалентно связаны с тканью. Тем не менее, после выполнения всех раундов усиления тирамидного сигнала также можно добавить последнее окрашивание вторичным антителом, непосредственно связанным с флуорохромом (без TSA). В некоторых панелях мы использовали этот метод для добавления окрашивания в канал 750. Это было необходимо, потому что в то время тирамид-AF750 не был коммерчески доступен. Следует отметить, что время воздействия (во время сканирования) антигена, окрашенного AF750, будет намного больше, чем для других антигенов, окрашенных TSA. В этом случае мы советуем окрашивать высокоэкспрессируемый белок, такой как цитокератин, или увеличивать концентрацию первичного антитела. Таким образом, можно окрашивать максимум пять-шесть антигенов на предметное стекло за одну партию в зависимости от флуоресцентного сканера.
Напротив, несколько коммерчески доступных методов используют серийное окрашивание с несколькими раундами окрашивания, сканирования и удаления или фотообесцвечивания для увеличения количества антигенов, которые могут быть окрашены на одном отдельном участке ткани. Однако эти методы часто отнимают много времени, дороги, не имеют усиления сигнала, требуют сложных вычислительных шагов для правильного объединения последовательных сканирований и, по нашему опыту, могут вызвать необратимое повреждение тканей из-за многочисленных этапов процедуры. Тем не менее, сообщалось, что до 30 антигенов могут быть окрашены на одной ткани с использованием этого метода14.
В заключение, наш метод представляет собой надежный, воспроизводимый, простой в использовании и экономичный метод иммуногистофлуоресценции, который можно использовать в любой лаборатории, имеющей флуоресцентный сканер слайдов. Можно использовать любое коммерциализированное первичное антитело, подходящее для ИГХ, и панели не являются специфическими для каких-либо коммерческих наборов. Анализ изображений может быть выполнен в нескольких различных программах, включая программы с открытым исходным кодом, такие как QuPath и R. Тем не менее, мы считаем, что этот метод может быть даже улучшен в будущем для больших панелей антигенов, что позволит выполнять серийное окрашивание/сканирование одного и того же предметного стекла с разными панелями антигенов и с преимуществом усиления сигнала.
Авторы хотели бы поблагодарить доктора Деруана Ф. за ее помощь и поддержку. Николя Юиг является научным сотрудником, получившим грант Бельгийского национального фонда научных исследований (Télévie/FNRS 7460918F).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
anti-CD3 primary antibody | Abcam | ab16669 | rabbit monocolonal |
anti-CD8 primary antibody | DAKO | M710301 | mouse monoclonal |
anti-hPanCK primary antibody | DAKO | M3515 | mouse monoclonal |
anti-PD-1 primary antibody | Cell Signalling | D4W2J | rabbit monocolonal |
anti-PD-L1 primary antibody | Cell Signalling | 13684 | rabbit monocolonal |
anti-RORC primary antibody | Sigma | MABF81 | mouse monoclonal |
ATTO-425 | ATTOtec | ||
Axioscan Z1 | Zeiss | Light source: Colibri 7 (385, 430, 475, 555, 590, 630, 735 nm) Filtersets: Excitation 379/34 – beam splitter 409 – emission 440/40; Excitation 438/24 – beam splitter 458 – emission 483/32; Excitation 490/20 – beam splitter 505 – emission 525/20; Excitation 546/10 – beam splitter 556 – emission 572/23; Excitation 592/21 – beam splitter 610 – emission 630/30; Excitation 635/18 – beam splitter 652 – emission 680/42; Excitation 735/40 – beam splitter QBS 405 + 493 + 611 + 762 - emission QBP 425/30 + 524/51 + 634/38 + 785/38; Objective: Plan-Apochromat 20x/0.8; Camera : Orca Flash 4.0 V3 | |
Borosilicate Cover Glass | VWR | 631-0146 | |
Envision+ anti-mouse | DAKO | K4001 | |
Envision+ anti-rabbit | DAKO | K4003 | |
Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 750 | ThermoFischer | A-21037 | |
HALO software | Indicalabs | ||
Hoescht | Sigma | 14533 | |
Superfrost plus microscope slides | Fisherscientific/Epredia | 10149870 | |
Tyramide-AF488 | ThermoFischer | B40953 | |
Tyramide-AF555 | ThermoFischer | B04955 | |
Tyramide-AF647 | ThermoFischer | B04958 |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved