이 작업은 후베이 핵심 연구소 개설 프로젝트(보조금 번호 2021KFY055), 후베이성 자연 과학 재단(보조금 번호 2020CFB240) 및 중앙 대학 기초 연구 기금(보조금 번호 2042020kf0065)의 지원을 받았습니다.

모든 단계는 달리 지시되지 않는 한 실온에서 수행됩니다. 사용된 모든 C57BL/6J 마우스는 우한대학교 동물실험센터에서 입수하였으며, 모든 관련 실험은 우한대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받았다. 생쥐의 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였습니다.
1. 눈의 적출 및 고정
<ol><li>생쥐를 이산화탄소 질식으로 안락사시키고 이빨이 없는 핀셋을 사용?...

망막 신경절 세포 연구를 위한 마우스 망막 분리 및 메탄올 치료

<ol>
	<li>Sanes, J. R., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+types+of+retinal+ganglion+cells:+Current+status+and+implications+for+neuronal+classification.">The types of retinal ganglion cells: Current status and implications for neuronal classification.</a> Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).</li><li>Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+retinal+ganglion+cell+death+in+glaucoma.">The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (2), 152-181 (2012).</li><li>Au, N. P. B., Ma, C. H. 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H., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fixation+protocols+for+adherent+cultured+cells+applied+to+a+GFP+fusion+protein+of+the+epidermal+growth+factor+receptor.">Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor.</a> Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).</li><li>Baykal, B., Korkmaz, C., Kocabiyik, N., Ceylan, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+post-fixation+on+visualising+vimentin+in+the+retina+using+immunofluorescence+method.">The influence of post-fixation on visualising vimentin in the retina using immunofluorescence method.</a> Folia Morphologica. 77 (2), 246-252 (2018).</li><li>Powner, M. 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고정은 망막을 보존하기 위한 필수 단계이며, 이는 형태학을 기반으로 한 후속 RGC 조사에 영향을 미칠 수 있습니다. 성공적인 고정은 망막을 고정 매체에 노출시키는 순간 망막의 구조와 상태를 빠르게 포착하며, 이는 추가 분석에 중요합니다. 포름 알데히드는 조직 및 세포 고정 및 보존을위한 가장 일반적인 고정제 중 하나로 간주되어 왔지만, 포름 알데히드만으로는 일부 조사에서 최적의 화학...

망막 신경절 세포(Retinal ganglion cell, RGC)는 망막에 있는 유일한 투영 뉴런으로, 외부 시각 정보를 통합하여 뇌에 전달한다1. 녹내장 및 외상성 시신경병증과 같은 많은 신경퇴행성 질환은 비가역적 손상과 RGC의 손실을 특징으로 한다 2,3. RGC의 형태학적 및 정량적 변화를 분석하는 것은 신경퇴행성 질환이 어떻게 발생하고 진행되는지를 결정하는 중요한 단계입니다 4,5.
간접 면역형광 분석은 단백질 분포 및 세포 계수를 모니터링하는 데 널리 사용되는 방법입니다. 실험실에서 망막의 생리학적 및 병리학적 상태를 평가하기 위해 RGC에 대한 실험적 연구에서 전체 마운트 망막 면역염색법이 일반적으로 사용됩니다6. 전체 망막에서 RGC 정량화에 사용되는 가장 일반적인 마커는 Brn3a, 다중 스플라이싱을 갖는 RNA 결합 단백질(RBPMS) 등을 포함합니다 7,8. RGC의 양과 분포를 특성화하려면 고품질의 전체 마운트 망막 면역염색이 필요합니다. 일반적으로, 면역염색 프로토콜에서, 망막은 항체에서 배양되기 전에 화학적 고정제에 담근다. 이상적인 고정제는 세포의 모양, 항체에 대한 에피토프의 접근성 또는 친화도, 또는 조직의 선형 치수를 변화시키지 않아야 한다 9,10.
망막의 복잡한 구조로 인해 망막의 취약성 및 접힘과 같은 문제뿐만 아니라 세포 수축 및 불분명한 핵을 포함한 몇 가지 일반적인 어려움이 전체 마운트 망막 패치를 만들 때 발생하기 쉬우며 이는 실험 연구에 부정적인 영향을 미칩니다. 또한, 모든 망막이 즉시 면역염색되는 것은 아니며, 특히 귀중한 기원의 값비싼 가격을 가진 형질전환 마우스의 망막의 경우 추가 사용을 위해 여분의 망막 샘플을 보존해야 합니다.
적절한 고정액은 조직을 신속하게 고정하고, 조직 자가분해를 피하고, 조직 세포의 정상적인 형태와 구조를 보존하고, 단백질 및 기타 물질의 항원성을 유지할 수 있다10. 현재, 포름알데히드계 고정술은 분리된 망막, 반절제된 안구, 안구 전체를 포함한 다양한 조직에서 널리 사용되고 있다10. 조직 수축과 세포의 형태학적 변화는 포름알데히드에 담근 후 직면하게 되는 두 가지 중요한 문제이다11. 또한, 망막 및 표적 세포의 본래 특성의 보유를 최대화하기 위해 변형된 고정 제형이 점점 더 등장하고 있다 9,10. 다른 망막 고정 치료는 망막 구조, 단백질 면역원성, 형광 여기 및 감쇠 소멸 주기에 다르게 영향을 미칠 수 있습니다12,13. 데이비슨 용액으로 고정된 망막은 포르말린으로 고정된 망막에 비해 형태학적으로 더 온전하지만, 데이비슨 용액은 소교세포 마커-이온화 칼슘 결합 어댑터 분자 112와 같은 일부 항체와의 호환성이 떨어진다. 망막의 깨지기 쉬운 특성을 고려할 때 연구자들은 망막 무결성과 표적 세포의 특성 및 형태가 장기 보관 후에 변할지 여부를 자연스럽게 궁금해할 것입니다. 그러나 수개월 보관 후 망막 및 RGC 세포 형태에 대한 고정 용액의 가능한 효과는 거의 보고되지 않았습니다. 망막 고정의 최적화는 RGC의 평가 및 보존에 중요합니다.
우리는 전체 마운트 쥐 망막 염색에 사용하는 신뢰할 수 있고 기술적으로 간단한 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 우리의 방법은 망막 조직의 장기 보관의 필요성과 형광단 형성 또는 분해의 특정 측면을 고려하여 RGC 조사를 위한 망막의 적절한 준비 및 보관을 강조합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well cell culture cluster</td>
			<td>Costar</td>
			<td></td>
			<td>Eyeball fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well hemagglutination plate</td>
			<td>Labedit Company</td>
			<td></td>
			<td>Incubation antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion microscope slides</td>
			<td>Citotest</td>
			<td></td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fluorescent quenching mountant</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G1401</td>
			<td>Slow down fluorescence quenching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (bovine serum albumin)</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>GC305010</td>
			<td>Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td></td>
			<td>Apply 40x objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved scissors</td>
			<td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>RWD Life science Co.,LTD&#160;</td>
			<td>77001S</td>
			<td>Dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>20210624</td>
			<td>GC&#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>SecheVite</td>
			<td></td>
			<td>Sealing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles&#160;</td>
			<td>Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Accelerate the fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G1101</td>
			<td>Eyeball fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate buffered saline pH 7.4)</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G0002</td>
			<td>Rinse the eyeball&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS)</td>
			<td>PhosphoSolutions</td>
			<td>Cat. #1832-RBPMS</td>
			<td>For immunofluorescence. Used at 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>706-165-148</td>
			<td>For immunofluorescence. Used at 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight scissors</td>
			<td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting tools</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methanol-based whole-mount preparation for the investigation of retinal ganglion cells

망막의 투영 뉴런인 망막 신경절 세포(RGC)는 외부 시각 정보를 뇌로 전파합니다. RGC의 병리학 적 변화는 수많은 망막 퇴행성 질환과 밀접한 관련이 있습니다. 전체 마운트 망막 면역염색은 망막의 발달 및 병리학적 상태를 평가하기 위해 RGC에 대한 실험적 연구에서 자주 사용됩니다. 어떤 상황에서는 형질전환 마우스의 샘플과 같은 일부 귀중한 망막 샘플을 RGC의 형태나 수에 영향을 미치지 않고 장기간 보관해야 할 수도 있습니다. 신뢰할 수 있고 재현 가능한 실험 결과를 위해서는 효과적인 보존 배지를 사용하는 것이 필수적입니다. 여기에서 우리는 망막 전체 장착 준비 및 장기 보관을 위한 보조 고정 배지로서의 메탄올의 효과를 설명합니다. 간단히 말해서, 분리 과정에서 차가운 메탄올(-20°C)을 망막 표면에 피펫팅하여 조직을 고정하고 투과성을 촉진한 다음 망막을 면역염색하기 전에 차가운 메탄올(-20°C)에 보관할 수 있습니다. 이 프로토콜은 RGC 조사에 유용하고 실용적인 망막 분리 워크플로 및 조직 샘플 보관 프로토콜을 설명합니다.

Retinal ganglion cells (RGCs) are the only projection neurons in the retina, and they integrate and transmit outside visual information to the brain1. Many neurodegenerative diseases such as glaucoma and traumatic optic neuropathy are characterized by irreversible damage and loss of RGCs2,3. Analyzing the morphological and quantitative changes of RGCs is a crucial step in determining how neurodegenerative diseases develop and advance4,5.
Indirect immunofluorescence assay is a widely accepted method to monitor the distribution of proteins and cell counting. In the laboratory, whole-mount retinal immunostaining is commonly used in experimental studies on RGCs to evaluate the physiological and pathological conditions of the retina6. The most common markers used for RGC quantification in the whole retina include Brn3a, RNA binding protein with multiple splicing (RBPMS), and so on7,8. Characterizing the amount and distribution of RGCs requires high-quality whole-mount retinal immunostaining. Generally, in immunostaining protocols, the retina is immersed in chemical fixatives before being incubated in antibodies. Ideal fixatives should not change the shape of cells, the accessibility or affinity of the epitopes for antibodies, or the linear dimensions of the tissue9,10. 
Due to the complex structure of the retina, problems such as retinal fragility and folding, as well as some common difficulties including cell shrinkage and unclear nuclei, are prone to occur when making a whole-mount retinal patch, which has a negative impact on experimental research. In addition, not all retinas are immunostained immediately, especially when it comes to the retinas of transgenic mice with expensive prices that are of precious origin, necessitating the preservation of the extra retinal samples for further use.
The appropriate fixative solution can fix the tissue quickly, avoid tissue autolysis, preserve the normal morphology and structure of the tissue cells, and keep the antigenicity of proteins and other substances10. At present, formaldehyde-based fixation has been widely used in various tissues, including separated retinas, hemisected eyecups, and whole eyeballs10. Tissue shrinkage and the morphological alteration of cells are the two critical challenges encountered following immersion in formaldehyde11. In addition, modified fixation formulations are increasingly emerging to maximize the retention of the original properties of the retina and the target cells9,10. Different retinal fixation treatments may affect the retinal structure, protein immunogenicity, fluorescence excitation , and attenuation quenching cycle differently12,13. Retinas fixed with Davidson's solution are more morphologically intact compared to those fixed with formalin, but Davidson's solution is less compatible with some antibodies, such as microglial marker-ionized calcium binding adaptor molecule 112. Considering the fragile nature of retinas, researchers would naturally wonder whether the retinal integrity, as well as the properties and morphology of the target cells, will change after long-term storage. However, the possible effects of fixation solution on retinal and RGC cell morphology after storage for several months have rarely been reported. The optimization of retinal fixation is critical for the evaluation and preservation of RGCs. 
We provide a detailed description of a reliable and technically straightforward method that we use for whole-mount murine retinal staining. Our method emphasizes the proper preparation and storage of retinas for RGC investigation, taking into account the need for the long-term storage of retinal tissue as well as specific aspects of fluorophore formation or degradation.

저자 스포트라이트: 망막 신경절 세포 연구를 위한 메탄올 기반 전체 장착 준비  

망막 신경절 세포 조사를 위한 메탄올 기반 전체 마운트 준비

The research aims to provide a modified retina isolation workflow and tissue sample storage protocol, which is useful and practical for investigating RGCs. Retinas are fragile and folding, which limits experimental research when making a whole-mount retinal patch. In addition, all retinas do not require immediate immunostain.Sometimes, extra retina samples need preservation for further use. We provide a detailed description of a reliable and technically straightforward method of whole-mount retina stain that emphasizes the proper preparation and the need for the long-term storage of retinas for RGC investigation. We will continue to work on the basic research of degenerative optic neuropathies.Further, the molecular mechanism of optic nerve injury and accident regeneration and potential clinical targets for diagnosing and treating neurodegenerative disease will be explored.

해부 후 망막은 편평한 네잎 클로버처럼 보일 것입니다. 이 연구에서는 위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 메탄올을 첨가한 후 망막이 하얗게 변했습니다(그림 1). 한편, 망막은 부드러움에서 유연하고 평평한 것으로 바뀌었습니다. 다음으로, RGC는 anti-RBPMS8로 라벨링되었습니다. 컨포칼 현미경(접안렌즈: 10x, 대물렌즈: 40x)을 사용하여 전체 마운트 망막(n = ...

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메탄올은 망막 전체 마운트 제제 및 장기 보관을 위한 보조 고정 배지로 사용할 수 있으며, 이는 망막 신경절 세포의 조사에 유용합니다.

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...

이 연구는 RGC를 조사하는 데 유용하고 실용적인 수정된 망막 분리 워크플로 및 조직 샘플 저장 프로토콜을 제공하는 것을 목표로 합니다. 망막은 깨지기 쉽고 접혀 있어 전체 마운트 망막 패치를 만들 때 실험적 연구를 제한합니다. 또한 모든 망막은 즉각적인 면역 염색이 필요하지 않습니다.때때로, 여분의 망막 샘플은 추가 사용을 위해 보존이 필요합니다. 우리는 RGC 조사를 위한 망막의 적절한 준비와 장기 보관의 필요성을 강조하는 전체 마운트 망막 염색의 신뢰할 수 있고 기술적으로 간단한 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 우리는 퇴행성 시신경 병증의 기초 연구를 계속할 것입니다.또한, 시신경 손상 및 사고 재생의 분자 메커니즘과 신경퇴행성 질환의 진단 및 치료를 위한 잠재적인 임상 표적을 탐구할 것입니다.

망막 신경절 세포 조사를 위한 메탄올 기반 전체 마운트 준비

Abstract