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Questo articolo fornisce una guida passo passo per stabilire una coltura primaria di cellule staminali di polpa dentale utilizzando il metodo della coltura di espiantazione e la caratterizzazione di queste cellule in base alle linee guida ICSCRT. Le cellule isolate da questo protocollo possono essere considerate come cellule staminali mesenchimali per ulteriori applicazioni.
La polpa dentale umana rappresenta un promettente serbatoio di cellule staminali multipotenti con una competenza rigenerativa preminente che può essere prelevata da un dente estratto. L'origine ecto-mesenchimale derivata dalla cresta neurale delle cellule staminali della polpa dentale (DPSC) conferisce un alto grado di plasticità che deve ai suoi molteplici benefici nella riparazione e rigenerazione dei tessuti. Ci sono vari modi pratici per raccogliere, mantenere e proliferare le cellule staminali adulte che vengono studiate per il loro uso nella medicina rigenerativa. In questo lavoro, dimostriamo la creazione di una coltura primaria di cellule staminali mesenchimali da tessuto dentale con il metodo della coltura di espianto. Le cellule isolate erano a forma di fuso e aderivano alla superficie plastica della piastra di coltura. La caratterizzazione fenotipica di queste cellule staminali ha mostrato un'espressione positiva dei marcatori di superficie cellulare raccomandati dalla società internazionale di terapia cellulare (ISCT) per le MSC, come CD90, CD73 e CD105. Inoltre, l'espressione trascurabile dei marcatori ematopoietici (CD45) ed endoteliali (CD34) e inferiore al 2% di espressione dei marcatori HLA-DR, hanno confermato l'omogeneità e la purezza delle colture DPSC. Abbiamo ulteriormente illustrato la loro multipotenza basata sulla differenziazione in linee adipogeniche, osteogeniche e condrogeniche. Abbiamo anche indotto queste cellule a differenziarsi in cellule simili a quelle epatiche e neuronali aggiungendo corrispondenti mezzi di stimolazione. Questo protocollo ottimizzato aiuterà nella coltivazione di una popolazione altamente espandibile di cellule staminali mesenchimali da utilizzare in laboratorio o per studi preclinici. Protocolli simili possono essere incorporati in configurazioni cliniche per la pratica di trattamenti basati su DPSC.
Le cellule staminali adulte si sono trasformate in un potente strumento terapeutico per trattamenti e terapie diretti alle cellule grazie alla loro plasticità, ai meccanismi paracrini e alle proprietà immunomodulatorie 1,2,3. I dati incoraggianti provenienti da studi preclinici basati su cellule staminali hanno ispirato i ricercatori a lavorare per la traduzione dal laboratorio al letto del paziente. Il tipo di cellule staminali utilizzate per la terapia con cellule staminali gioca un ruolo significativo nei risultati di successo. Negli studi preclinici e clinici, la fonte pi....
Tutte le procedure descritte nello studio sono state approvate dal Comitato Etico dell'Istituto (IEC# 9195/PG-12 ITRG/2571-72) di PGIMER, Chandigarh. Tutti gli esperimenti relativi alle colture cellulari devono essere eseguiti in una cabina di sicurezza biologica (BSC) di Classe II seguendo una tecnica asettica. La polpa dentale è stata ottenuta da denti sani di tre pazienti (F/14, M/14 e M/20) sottoposti a estrazioni del terzo molare per motivi ortodontici. Prima della raccolta del campione, è stato ottenuto il consen.......
Qui, descriviamo come i ricercatori possono stabilire una coltura pura di DPSC tramite il metodo di espiantazione 6,7,8,9,10 e indurli verso più lignaggi per stabilire la purezza della coltura per le applicazioni a valle.
Abbiamo stabilito una coltura primaria di DPSC dal piccolo tessuto di polpa estratto dal terzo molare .......
Le cellule staminali hanno riposto le speranze di curare numerose malattie, grazie alla loro plasticità, robustezza, proprietà immunomodulatorie, meccanismi paracrini ed efficienza di homing. Il tessuto pulpare dentale è considerato la fonte più potente e preziosa di cellule staminali, con un'eminente plasticità e una capacità rigenerativa. Qui, dimostriamo l'isolamento delle DPSC, utilizzando il metodo di coltura dell'espianto, ampiamente adottato, in cui le cellule migrano da pezzi di tessuto pulpare o espianti p.......
Riconosciamo il sostegno finanziario all'AK da parte del Dipartimento di Ricerca Sanitaria (DHR), ICMR, Govt. dell'India (DHR-NRI Grant # R.12015/01/2022-HR). SR ha ricevuto finanziamenti da ICMR, Govt. dell'India (Grant # 2020-7593/SCR-BMS) e PS ha ricevuto una borsa di studio da CSIR, Govt. of India. Siamo anche grati alla signora Sandhya Tokhi e alla signora Bhupinder Kaur per l'assistenza nella citometria a flusso, al nucleo centrale di strumentazione sofisticata (CSIC) e al PGIMER, Chandigarh per aver fornito supporto infrastrutturale.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
6 well cell culture plate | Costar | 3516 | For cell culture |
Alcian blue stain | EZstain chondrocyte staining kit, HiMedia | CCK029 | |
alizarin red S stain | Sigma-Aldrich | TMS-008 | Osteogenic stain |
Antibiotic cocktail | Himedia | A002-5X50ML | To prevent culture contamination |
Ascorbic Acid | Himedia | TC094-25G | Chondrogenic induction |
B27 supplement | Gibco | 17504044 | For neural induction |
bFGF ( basic Fibroblast Growth Factor) | Gibco | PHG0024 | For neural induction |
CD 105 | BD-Pharmingen | 560839 | |
CD 35 | Biolegend | 343604 | |
CD 45 | Biolegend | 304006 | |
CD 73 | Biolegend | 344016 | |
CD 90 | Biolegend | 328107 | Characterization |
cetyl pyridinium chloride (CPC) | Sigma-Aldrich | 1104006 | For Alizarin Red extraction |
Dexamethasone 21-phosphate disodium | Sigma-Aldrich | D1159-100MG | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Himedia | TS1006-5L | For washing purpose |
EGF (Epidermal Growth Factor) | Gibco | PHG0311 | For hepatic and neural induction |
EVOS LED microscope | Invitrogen | For fluorescence imaging | |
EZ stain Chondrocyte staining kit | Himedia | CCK029-1KT | Chondro stain Kit |
FACS Canto flow cytometer | BD Biosciences | For cell characterization | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | For primary culture |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | For cell culture |
G5 supplement | Gibco | 17503012 | For neural induction |
HGF( Hepatocyte Growth Factor) | Sigma-Aldrich | H1404 | For hepatic Induction |
HLA-DR | Biolegend | 307605 | |
Human TGF-β3 | Peprotech | #100-36E-10U | |
Insulin-Transferrin-Selenous acid premix | Sigma-Aldrich | I3146 | For hepatic Induction |
ITS premix | Corning | 354350 | |
LDL Uptake Assay kit | Abcam | ab133127 | For hepatic characterization |
Low glucose DMEM | Gibco | 11885-084 | For hepatic induction |
MAP2 antibody | Sigma-Aldrich | M4403 | For neural characterization |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | For neural induction |
Neural Basal Media | Gibco | 21103049 | For neural induction |
NFM antibody | Sigma-Aldrich | N4142 | For neural characterization |
Nikon Elipse TS100 microscope | Nikon | For fluorescence imaging | |
Oil Red O | Sigma-Aldrich | 01391-250Ml | Adipogenic stain |
Oncostatin M | R&D Systems | 295-OM-010/CF | For hepatic Induction |
Petridish | Tarson | 460090-90MM | For tissue cutting |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 15655-100G | Osteogenic induction |
Propan-2-ol | Thermo Fisher | Q13827 | For Oil Red O extraction |
Sodium pyruvate solution | Sigma life sciences | S8636-100ML | |
Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | For cell passaging |
Whatman filter paper | merck | WHA1001325 | filter paper |
α- Minimum Essential Media (α-MEM) | Sigma-Aldrich | M0643-10X 1L | Media for primary culture |
β-glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422-50G |
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