Coltura primaria di cellule staminali della polpa dentale

Summary

Questo articolo fornisce una guida passo passo per stabilire una coltura primaria di cellule staminali di polpa dentale utilizzando il metodo della coltura di espiantazione e la caratterizzazione di queste cellule in base alle linee guida ICSCRT. Le cellule isolate da questo protocollo possono essere considerate come cellule staminali mesenchimali per ulteriori applicazioni.

Abstract

La polpa dentale umana rappresenta un promettente serbatoio di cellule staminali multipotenti con una competenza rigenerativa preminente che può essere prelevata da un dente estratto. L'origine ecto-mesenchimale derivata dalla cresta neurale delle cellule staminali della polpa dentale (DPSC) conferisce un alto grado di plasticità che deve ai suoi molteplici benefici nella riparazione e rigenerazione dei tessuti. Ci sono vari modi pratici per raccogliere, mantenere e proliferare le cellule staminali adulte che vengono studiate per il loro uso nella medicina rigenerativa. In questo lavoro, dimostriamo la creazione di una coltura primaria di cellule staminali mesenchimali da tessuto dentale con il metodo della coltura di espianto. Le cellule isolate erano a forma di fuso e aderivano alla superficie plastica della piastra di coltura. La caratterizzazione fenotipica di queste cellule staminali ha mostrato un'espressione positiva dei marcatori di superficie cellulare raccomandati dalla società internazionale di terapia cellulare (ISCT) per le MSC, come CD90, CD73 e CD105. Inoltre, l'espressione trascurabile dei marcatori ematopoietici (CD45) ed endoteliali (CD34) e inferiore al 2% di espressione dei marcatori HLA-DR, hanno confermato l'omogeneità e la purezza delle colture DPSC. Abbiamo ulteriormente illustrato la loro multipotenza basata sulla differenziazione in linee adipogeniche, osteogeniche e condrogeniche. Abbiamo anche indotto queste cellule a differenziarsi in cellule simili a quelle epatiche e neuronali aggiungendo corrispondenti mezzi di stimolazione. Questo protocollo ottimizzato aiuterà nella coltivazione di una popolazione altamente espandibile di cellule staminali mesenchimali da utilizzare in laboratorio o per studi preclinici. Protocolli simili possono essere incorporati in configurazioni cliniche per la pratica di trattamenti basati su DPSC.

Introduction

Le cellule staminali adulte si sono trasformate in un potente strumento terapeutico per trattamenti e terapie diretti alle cellule grazie alla loro plasticità, ai meccanismi paracrini e alle proprietà immunomodulatorie ^1,2,3. I dati incoraggianti provenienti da studi preclinici basati su cellule staminali hanno ispirato i ricercatori a lavorare per la traduzione dal laboratorio al letto del paziente. Il tipo di cellule staminali utilizzate per la terapia con cellule staminali gioca un ruolo significativo nei risultati di successo. Negli studi preclinici e clinici, la fonte pi....

Protocol

Tutte le procedure descritte nello studio sono state approvate dal Comitato Etico dell'Istituto (IEC# 9195/PG-12 ITRG/2571-72) di PGIMER, Chandigarh. Tutti gli esperimenti relativi alle colture cellulari devono essere eseguiti in una cabina di sicurezza biologica (BSC) di Classe II seguendo una tecnica asettica. La polpa dentale è stata ottenuta da denti sani di tre pazienti (F/14, M/14 e M/20) sottoposti a estrazioni del terzo molare per motivi ortodontici. Prima della raccolta del campione, è stato ottenuto il consen.......

Discussion

Le cellule staminali hanno riposto le speranze di curare numerose malattie, grazie alla loro plasticità, robustezza, proprietà immunomodulatorie, meccanismi paracrini ed efficienza di homing. Il tessuto pulpare dentale è considerato la fonte più potente e preziosa di cellule staminali, con un'eminente plasticità e una capacità rigenerativa. Qui, dimostriamo l'isolamento delle DPSC, utilizzando il metodo di coltura dell'espianto, ampiamente adottato, in cui le cellule migrano da pezzi di tessuto pulpare o espianti p.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 well cell culture plate	Costar	3516	For cell culture
Alcian blue stain	EZstain chondrocyte staining kit, HiMedia	CCK029
alizarin red S stain	Sigma-Aldrich	TMS-008	Osteogenic stain
Antibiotic cocktail	Himedia	A002-5X50ML	To prevent culture contamination
Ascorbic Acid	Himedia	TC094-25G	Chondrogenic induction
B27 supplement	Gibco	17504044	For neural induction
bFGF ( basic Fibroblast Growth Factor)	Gibco	PHG0024	For neural induction
CD 105	BD-Pharmingen	560839
CD 35	Biolegend	343604
CD 45	Biolegend	304006
CD 73	Biolegend	344016
CD 90	Biolegend	328107	Characterization
cetyl pyridinium chloride (CPC)	Sigma-Aldrich	1104006	For Alizarin Red extraction
Dexamethasone 21-phosphate disodium	Sigma-Aldrich	D1159-100MG
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Himedia	TS1006-5L	For washing purpose
EGF (Epidermal Growth Factor)	Gibco	PHG0311	For hepatic and neural  induction
EVOS LED microscope	Invitrogen		For  fluorescence imaging
EZ stain Chondrocyte staining kit	Himedia	CCK029-1KT	Chondro stain Kit
FACS Canto flow cytometer	BD Biosciences		For cell characterization
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	For primary culture
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442	For cell culture
G5 supplement	Gibco	17503012	For neural induction
HGF( Hepatocyte Growth Factor)	Sigma-Aldrich	H1404	For hepatic Induction
HLA-DR	Biolegend	307605
Human TGF-β3	Peprotech	#100-36E-10U
Insulin-Transferrin-Selenous acid premix	Sigma-Aldrich	I3146	For hepatic Induction
ITS premix	Corning	354350
LDL Uptake Assay kit	Abcam	ab133127	For hepatic characterization
Low glucose DMEM	Gibco	11885-084	For hepatic induction
MAP2 antibody	Sigma-Aldrich	M4403	For neural characterization
N2 supplement	Gibco	17502048	For neural induction
Neural Basal Media	Gibco	21103049	For neural induction
NFM antibody	Sigma-Aldrich	N4142	For neural characterization
Nikon Elipse TS100 microscope	Nikon		For  fluorescence imaging
Oil Red O	Sigma-Aldrich	01391-250Ml	Adipogenic stain
Oncostatin M	R&D Systems	295-OM-010/CF	For hepatic Induction
Petridish	Tarson	460090-90MM	For tissue cutting
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	15655-100G	Osteogenic induction
Propan-2-ol	Thermo Fisher	Q13827	For Oil Red O extraction
Sodium pyruvate solution	Sigma life sciences	S8636-100ML
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	For cell passaging
Whatman filter paper	merck	WHA1001325	filter paper
α- Minimum Essential Media (α-MEM)	Sigma-Aldrich	M0643-10X 1L	Media for primary culture
β-glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G9422-50G