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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Questo articolo fornisce una guida passo passo per stabilire una coltura primaria di cellule staminali di polpa dentale utilizzando il metodo della coltura di espiantazione e la caratterizzazione di queste cellule in base alle linee guida ICSCRT. Le cellule isolate da questo protocollo possono essere considerate come cellule staminali mesenchimali per ulteriori applicazioni.

Abstract

La polpa dentale umana rappresenta un promettente serbatoio di cellule staminali multipotenti con una competenza rigenerativa preminente che può essere prelevata da un dente estratto. L'origine ecto-mesenchimale derivata dalla cresta neurale delle cellule staminali della polpa dentale (DPSC) conferisce un alto grado di plasticità che deve ai suoi molteplici benefici nella riparazione e rigenerazione dei tessuti. Ci sono vari modi pratici per raccogliere, mantenere e proliferare le cellule staminali adulte che vengono studiate per il loro uso nella medicina rigenerativa. In questo lavoro, dimostriamo la creazione di una coltura primaria di cellule staminali mesenchimali da tessuto dentale con il metodo della coltura di espianto. Le cellule isolate erano a forma di fuso e aderivano alla superficie plastica della piastra di coltura. La caratterizzazione fenotipica di queste cellule staminali ha mostrato un'espressione positiva dei marcatori di superficie cellulare raccomandati dalla società internazionale di terapia cellulare (ISCT) per le MSC, come CD90, CD73 e CD105. Inoltre, l'espressione trascurabile dei marcatori ematopoietici (CD45) ed endoteliali (CD34) e inferiore al 2% di espressione dei marcatori HLA-DR, hanno confermato l'omogeneità e la purezza delle colture DPSC. Abbiamo ulteriormente illustrato la loro multipotenza basata sulla differenziazione in linee adipogeniche, osteogeniche e condrogeniche. Abbiamo anche indotto queste cellule a differenziarsi in cellule simili a quelle epatiche e neuronali aggiungendo corrispondenti mezzi di stimolazione. Questo protocollo ottimizzato aiuterà nella coltivazione di una popolazione altamente espandibile di cellule staminali mesenchimali da utilizzare in laboratorio o per studi preclinici. Protocolli simili possono essere incorporati in configurazioni cliniche per la pratica di trattamenti basati su DPSC.

Introduction

Le cellule staminali adulte si sono trasformate in un potente strumento terapeutico per trattamenti e terapie diretti alle cellule grazie alla loro plasticità, ai meccanismi paracrini e alle proprietà immunomodulatorie 1,2,3. I dati incoraggianti provenienti da studi preclinici basati su cellule staminali hanno ispirato i ricercatori a lavorare per la traduzione dal laboratorio al letto del paziente. Il tipo di cellule staminali utilizzate per la terapia con cellule staminali gioca un ruolo significativo nei risultati di successo. Negli studi preclinici e clinici, la fonte pi....

Protocol

Tutte le procedure descritte nello studio sono state approvate dal Comitato Etico dell'Istituto (IEC# 9195/PG-12 ITRG/2571-72) di PGIMER, Chandigarh. Tutti gli esperimenti relativi alle colture cellulari devono essere eseguiti in una cabina di sicurezza biologica (BSC) di Classe II seguendo una tecnica asettica. La polpa dentale è stata ottenuta da denti sani di tre pazienti (F/14, M/14 e M/20) sottoposti a estrazioni del terzo molare per motivi ortodontici. Prima della raccolta del campione, è stato ottenuto il consen.......

Representative Results

Qui, descriviamo come i ricercatori possono stabilire una coltura pura di DPSC tramite il metodo di espiantazione 6,7,8,9,10 e indurli verso più lignaggi per stabilire la purezza della coltura per le applicazioni a valle.

Abbiamo stabilito una coltura primaria di DPSC dal piccolo tessuto di polpa estratto dal terzo molare .......

Discussion

Le cellule staminali hanno riposto le speranze di curare numerose malattie, grazie alla loro plasticità, robustezza, proprietà immunomodulatorie, meccanismi paracrini ed efficienza di homing. Il tessuto pulpare dentale è considerato la fonte più potente e preziosa di cellule staminali, con un'eminente plasticità e una capacità rigenerativa. Qui, dimostriamo l'isolamento delle DPSC, utilizzando il metodo di coltura dell'espianto, ampiamente adottato, in cui le cellule migrano da pezzi di tessuto pulpare o espianti p.......

Acknowledgements

Riconosciamo il sostegno finanziario all'AK da parte del Dipartimento di Ricerca Sanitaria (DHR), ICMR, Govt. dell'India (DHR-NRI Grant # R.12015/01/2022-HR). SR ha ricevuto finanziamenti da ICMR, Govt. dell'India (Grant # 2020-7593/SCR-BMS) e PS ha ricevuto una borsa di studio da CSIR, Govt. of India. Siamo anche grati alla signora Sandhya Tokhi e alla signora Bhupinder Kaur per l'assistenza nella citometria a flusso, al nucleo centrale di strumentazione sofisticata (CSIC) e al PGIMER, Chandigarh per aver fornito supporto infrastrutturale.

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
6 well cell culture plateCostar3516For cell culture
Alcian blue stainEZstain chondrocyte staining kit, HiMediaCCK029
alizarin red S stainSigma-AldrichTMS-008Osteogenic stain
Antibiotic cocktailHimediaA002-5X50MLTo prevent culture contamination
Ascorbic AcidHimediaTC094-25GChondrogenic induction
B27 supplementGibco17504044For neural induction
bFGF ( basic Fibroblast Growth Factor)GibcoPHG0024For neural induction
CD 105BD-Pharmingen560839
CD 35Biolegend343604
CD 45Biolegend304006
CD 73Biolegend344016
CD 90Biolegend328107Characterization
cetyl pyridinium chloride (CPC)Sigma-Aldrich1104006For Alizarin Red extraction
Dexamethasone 21-phosphate disodiumSigma-AldrichD1159-100MG
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineHimediaTS1006-5LFor washing purpose
EGF (Epidermal Growth Factor)GibcoPHG0311For hepatic and neural  induction
EVOS LED microscopeInvitrogenFor  fluorescence imaging
EZ stain Chondrocyte staining kitHimediaCCK029-1KTChondro stain Kit
FACS Canto flow cytometerBD BiosciencesFor cell characterization
Fetal Bovine SerumGibco16000044For primary culture
Fetal Bovine SerumSigma-AldrichF2442For cell culture
G5 supplementGibco17503012For neural induction
HGF( Hepatocyte Growth Factor)Sigma-AldrichH1404For hepatic Induction
HLA-DRBiolegend307605
 Human TGF-β3Peprotech#100-36E-10U
Insulin-Transferrin-Selenous acid premixSigma-AldrichI3146For hepatic Induction
ITS premixCorning354350
LDL Uptake Assay kitAbcamab133127For hepatic characterization
Low glucose DMEMGibco11885-084For hepatic induction
MAP2 antibodySigma-AldrichM4403For neural characterization
N2 supplementGibco17502048For neural induction
Neural Basal MediaGibco21103049For neural induction
NFM antibodySigma-AldrichN4142For neural characterization
Nikon Elipse TS100 microscopeNikonFor  fluorescence imaging
Oil Red OSigma-Aldrich01391-250MlAdipogenic stain
Oncostatin MR&D Systems295-OM-010/CFFor hepatic Induction
PetridishTarson460090-90MMFor tissue cutting
Potassium phosphate monobasicSigma-Aldrich15655-100GOsteogenic induction
Propan-2-olThermo FisherQ13827For Oil Red O extraction
Sodium pyruvate solutionSigma life sciencesS8636-100ML
Trypsin-EDTASigma-AldrichT4049For cell passaging
Whatman filter papermerckWHA1001325filter paper
α- Minimum Essential Media (α-MEM)Sigma-AldrichM0643-10X 1LMedia for primary culture
β-glycerophosphate disodium salt hydrateSigma-AldrichG9422-50G

References

  1. Bhattacharyya, S., Kumar, A., Lal Khanduja, K. The voyage of stem cell toward terminal differentiation: a brief overview. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 44 (6), 463-475 (2012).
  2. Prentice, D. A. Adult stem cells. Circulati....

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