Cultura Primária de Células-Tronco da Polpa Dentária

Summary

Este artigo fornece um guia passo a passo para estabelecer uma cultura primária de células-tronco de polpa dentária usando o método de cultura de explante e caracterização dessas células com base nas diretrizes do ICSCRT. As células isoladas por este protocolo podem ser consideradas como células-tronco mesenquimais para futuras aplicações.

Abstract

A polpa dentária humana representa um reservatório promissor de células-tronco multipotentes com competência regenerativa preeminente que pode ser colhido de um dente extraído. A origem ecto-mesenquimal derivada da crista neural das células-tronco da polpa dentária (DPSCs) confere um alto grau de plasticidade que se deve aos seus benefícios multifacetados no reparo e regeneração de tecidos. Existem várias maneiras práticas de coletar, manter e proliferar células-tronco adultas sendo investigadas para seu uso na medicina regenerativa. Neste trabalho, demonstramos o estabelecimento de uma cultura primária de células-tronco mesenquimais a partir de tecido dentário pelo método de cultura de explante. As células isoladas foram fusiformes e aderidas à superfície plástica da placa de cultura. A caracterização fenotípica dessas células-tronco mostrou expressão positiva de marcadores de superfície celular recomendados pela sociedade internacional de terapia celular (ISCT) para MSC, como CD90, CD73 e CD105. Além disso, a expressão insignificante de marcadores hematopoiéticos (CD45) e endoteliais (CD34) e menos de 2% de expressão de marcadores HLA-DR confirmaram a homogeneidade e pureza das culturas de DPSC. Ilustramos ainda sua multipotência com base na diferenciação para linhagens adipogênicas, osteogênicas e condrogênicas. Também induzimos essas células a se diferenciarem em células hepáticas e neuronais, adicionando meios de estimulação correspondentes. Este protocolo otimizado ajudará no cultivo de uma população altamente expansível de células-tronco mesenquimais para serem utilizadas em laboratório ou para estudos pré-clínicos. Protocolos semelhantes podem ser incorporados em configurações clínicas para a prática de tratamentos baseados em DPSC.

Introduction

As células-tronco adultas tornaram-se uma poderosa ferramenta terapêutica para tratamentos e terapias direcionadas a células devido à sua plasticidade, mecanismos parácrinos e propriedades imunomoduladoras ^1,2,3. Os dados encorajadores de estudos pré-clínicos baseados em células-tronco inspiraram os pesquisadores a trabalhar pela tradução da bancada para a beira do leito. O tipo de células-tronco usadas para terapia com células-tronco desempenha um papel significativo nos resultados bem-sucedidos. Em estudos pré-clínicos e clínicos, a fonte mais amplamente relatada de células....

Protocol

Todos os procedimentos descritos no estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética do Instituto (IEC# 9195/PG-12 ITRG/2571-72) do PGIMER, Chandigarh. Todas as experiências relacionadas com a cultura de células devem ser realizadas numa cabina de segurança biológica (BSC) de classe II, seguindo uma técnica asséptica. A polpa dentária foi obtida de dentes saudáveis de três pacientes (F/14, M/14 e M/20) submetidos a extrações de terceiros molares por razões ortodônticas. Antes da coleta da amostra, o consentimen.......

Discussion

As células-tronco depositaram as esperanças de curar inúmeras doenças, devido à sua plasticidade, robustez, propriedades imunomoduladoras, mecanismos parácrinos e eficiências de homing. O tecido pulpar dentário é considerado a fonte mais potente e valiosa de células-tronco, com plasticidade eminente e capacidade regenerativa. Aqui, demonstramos o isolamento de DPSCs, utilizando o método de cultura de explante amplamente adotado, no qual as células migram de pedaços de tecido pulpar ou explantes para crescer .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 well cell culture plate	Costar	3516	For cell culture
Alcian blue stain	EZstain chondrocyte staining kit, HiMedia	CCK029
alizarin red S stain	Sigma-Aldrich	TMS-008	Osteogenic stain
Antibiotic cocktail	Himedia	A002-5X50ML	To prevent culture contamination
Ascorbic Acid	Himedia	TC094-25G	Chondrogenic induction
B27 supplement	Gibco	17504044	For neural induction
bFGF ( basic Fibroblast Growth Factor)	Gibco	PHG0024	For neural induction
CD 105	BD-Pharmingen	560839
CD 35	Biolegend	343604
CD 45	Biolegend	304006
CD 73	Biolegend	344016
CD 90	Biolegend	328107	Characterization
cetyl pyridinium chloride (CPC)	Sigma-Aldrich	1104006	For Alizarin Red extraction
Dexamethasone 21-phosphate disodium	Sigma-Aldrich	D1159-100MG
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Himedia	TS1006-5L	For washing purpose
EGF (Epidermal Growth Factor)	Gibco	PHG0311	For hepatic and neural  induction
EVOS LED microscope	Invitrogen		For  fluorescence imaging
EZ stain Chondrocyte staining kit	Himedia	CCK029-1KT	Chondro stain Kit
FACS Canto flow cytometer	BD Biosciences		For cell characterization
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	For primary culture
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442	For cell culture
G5 supplement	Gibco	17503012	For neural induction
HGF( Hepatocyte Growth Factor)	Sigma-Aldrich	H1404	For hepatic Induction
HLA-DR	Biolegend	307605
Human TGF-β3	Peprotech	#100-36E-10U
Insulin-Transferrin-Selenous acid premix	Sigma-Aldrich	I3146	For hepatic Induction
ITS premix	Corning	354350
LDL Uptake Assay kit	Abcam	ab133127	For hepatic characterization
Low glucose DMEM	Gibco	11885-084	For hepatic induction
MAP2 antibody	Sigma-Aldrich	M4403	For neural characterization
N2 supplement	Gibco	17502048	For neural induction
Neural Basal Media	Gibco	21103049	For neural induction
NFM antibody	Sigma-Aldrich	N4142	For neural characterization
Nikon Elipse TS100 microscope	Nikon		For  fluorescence imaging
Oil Red O	Sigma-Aldrich	01391-250Ml	Adipogenic stain
Oncostatin M	R&D Systems	295-OM-010/CF	For hepatic Induction
Petridish	Tarson	460090-90MM	For tissue cutting
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	15655-100G	Osteogenic induction
Propan-2-ol	Thermo Fisher	Q13827	For Oil Red O extraction
Sodium pyruvate solution	Sigma life sciences	S8636-100ML
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	For cell passaging
Whatman filter paper	merck	WHA1001325	filter paper
α- Minimum Essential Media (α-MEM)	Sigma-Aldrich	M0643-10X 1L	Media for primary culture
β-glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G9422-50G