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Este artigo fornece um guia passo a passo para estabelecer uma cultura primária de células-tronco de polpa dentária usando o método de cultura de explante e caracterização dessas células com base nas diretrizes do ICSCRT. As células isoladas por este protocolo podem ser consideradas como células-tronco mesenquimais para futuras aplicações.
A polpa dentária humana representa um reservatório promissor de células-tronco multipotentes com competência regenerativa preeminente que pode ser colhido de um dente extraído. A origem ecto-mesenquimal derivada da crista neural das células-tronco da polpa dentária (DPSCs) confere um alto grau de plasticidade que se deve aos seus benefícios multifacetados no reparo e regeneração de tecidos. Existem várias maneiras práticas de coletar, manter e proliferar células-tronco adultas sendo investigadas para seu uso na medicina regenerativa. Neste trabalho, demonstramos o estabelecimento de uma cultura primária de células-tronco mesenquimais a partir de tecido dentário pelo método de cultura de explante. As células isoladas foram fusiformes e aderidas à superfície plástica da placa de cultura. A caracterização fenotípica dessas células-tronco mostrou expressão positiva de marcadores de superfície celular recomendados pela sociedade internacional de terapia celular (ISCT) para MSC, como CD90, CD73 e CD105. Além disso, a expressão insignificante de marcadores hematopoiéticos (CD45) e endoteliais (CD34) e menos de 2% de expressão de marcadores HLA-DR confirmaram a homogeneidade e pureza das culturas de DPSC. Ilustramos ainda sua multipotência com base na diferenciação para linhagens adipogênicas, osteogênicas e condrogênicas. Também induzimos essas células a se diferenciarem em células hepáticas e neuronais, adicionando meios de estimulação correspondentes. Este protocolo otimizado ajudará no cultivo de uma população altamente expansível de células-tronco mesenquimais para serem utilizadas em laboratório ou para estudos pré-clínicos. Protocolos semelhantes podem ser incorporados em configurações clínicas para a prática de tratamentos baseados em DPSC.
As células-tronco adultas tornaram-se uma poderosa ferramenta terapêutica para tratamentos e terapias direcionadas a células devido à sua plasticidade, mecanismos parácrinos e propriedades imunomoduladoras 1,2,3. Os dados encorajadores de estudos pré-clínicos baseados em células-tronco inspiraram os pesquisadores a trabalhar pela tradução da bancada para a beira do leito. O tipo de células-tronco usadas para terapia com células-tronco desempenha um papel significativo nos resultados bem-sucedidos. Em estudos pré-clínicos e clínicos, a fonte mais amplamente relatada de células....
Todos os procedimentos descritos no estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética do Instituto (IEC# 9195/PG-12 ITRG/2571-72) do PGIMER, Chandigarh. Todas as experiências relacionadas com a cultura de células devem ser realizadas numa cabina de segurança biológica (BSC) de classe II, seguindo uma técnica asséptica. A polpa dentária foi obtida de dentes saudáveis de três pacientes (F/14, M/14 e M/20) submetidos a extrações de terceiros molares por razões ortodônticas. Antes da coleta da amostra, o consentimen.......
Aqui, descrevemos como os pesquisadores podem estabelecer uma cultura pura de DPSCs por meio do método de explante 6,7,8,9,10 e induzi-los a várias linhagens para estabelecer a pureza da cultura para aplicações a jusante.
Estabelecemos uma cultura primária de DPSCs a partir do pequeno tecido de polpa extraído do terce.......
As células-tronco depositaram as esperanças de curar inúmeras doenças, devido à sua plasticidade, robustez, propriedades imunomoduladoras, mecanismos parácrinos e eficiências de homing. O tecido pulpar dentário é considerado a fonte mais potente e valiosa de células-tronco, com plasticidade eminente e capacidade regenerativa. Aqui, demonstramos o isolamento de DPSCs, utilizando o método de cultura de explante amplamente adotado, no qual as células migram de pedaços de tecido pulpar ou explantes para crescer .......
Os autores declaram não haver conflito de interesses financeiro ou não financeiro.
Reconhecemos o apoio financeiro à AK do Departamento de Pesquisa em Saúde (DHR), ICMR, Govt. da Índia (DHR-NRI Grant # R.12015/01/2022-HR). SR recebeu financiamento do ICMR, Govt. da Índia (Grant # 2020-7593/SCR-BMS) e PS recebeu bolsa do CSIR, Govt. da Índia. Também somos gratos à Sra. Sandhya Tokhi e à Sra. Bhupinder Kaur pela assistência na citometria de fluxo e ao núcleo central de instrumentação sofisticada (CSIC) e ao PGIMER, Chandigarh por fornecer suporte de infraestrutura.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
6 well cell culture plate | Costar | 3516 | For cell culture |
Alcian blue stain | EZstain chondrocyte staining kit, HiMedia | CCK029 | |
alizarin red S stain | Sigma-Aldrich | TMS-008 | Osteogenic stain |
Antibiotic cocktail | Himedia | A002-5X50ML | To prevent culture contamination |
Ascorbic Acid | Himedia | TC094-25G | Chondrogenic induction |
B27 supplement | Gibco | 17504044 | For neural induction |
bFGF ( basic Fibroblast Growth Factor) | Gibco | PHG0024 | For neural induction |
CD 105 | BD-Pharmingen | 560839 | |
CD 35 | Biolegend | 343604 | |
CD 45 | Biolegend | 304006 | |
CD 73 | Biolegend | 344016 | |
CD 90 | Biolegend | 328107 | Characterization |
cetyl pyridinium chloride (CPC) | Sigma-Aldrich | 1104006 | For Alizarin Red extraction |
Dexamethasone 21-phosphate disodium | Sigma-Aldrich | D1159-100MG | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Himedia | TS1006-5L | For washing purpose |
EGF (Epidermal Growth Factor) | Gibco | PHG0311 | For hepatic and neural induction |
EVOS LED microscope | Invitrogen | For fluorescence imaging | |
EZ stain Chondrocyte staining kit | Himedia | CCK029-1KT | Chondro stain Kit |
FACS Canto flow cytometer | BD Biosciences | For cell characterization | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | For primary culture |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | For cell culture |
G5 supplement | Gibco | 17503012 | For neural induction |
HGF( Hepatocyte Growth Factor) | Sigma-Aldrich | H1404 | For hepatic Induction |
HLA-DR | Biolegend | 307605 | |
Human TGF-β3 | Peprotech | #100-36E-10U | |
Insulin-Transferrin-Selenous acid premix | Sigma-Aldrich | I3146 | For hepatic Induction |
ITS premix | Corning | 354350 | |
LDL Uptake Assay kit | Abcam | ab133127 | For hepatic characterization |
Low glucose DMEM | Gibco | 11885-084 | For hepatic induction |
MAP2 antibody | Sigma-Aldrich | M4403 | For neural characterization |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | For neural induction |
Neural Basal Media | Gibco | 21103049 | For neural induction |
NFM antibody | Sigma-Aldrich | N4142 | For neural characterization |
Nikon Elipse TS100 microscope | Nikon | For fluorescence imaging | |
Oil Red O | Sigma-Aldrich | 01391-250Ml | Adipogenic stain |
Oncostatin M | R&D Systems | 295-OM-010/CF | For hepatic Induction |
Petridish | Tarson | 460090-90MM | For tissue cutting |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 15655-100G | Osteogenic induction |
Propan-2-ol | Thermo Fisher | Q13827 | For Oil Red O extraction |
Sodium pyruvate solution | Sigma life sciences | S8636-100ML | |
Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | For cell passaging |
Whatman filter paper | merck | WHA1001325 | filter paper |
α- Minimum Essential Media (α-MEM) | Sigma-Aldrich | M0643-10X 1L | Media for primary culture |
β-glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422-50G |
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