Первичная культура стволовых клеток пульпы зуба

Summary

В этой статье представлено пошаговое руководство по созданию первичной культуры стволовых клеток пульпы зубов с использованием метода культивирования эксплантов и характеристике этих клеток на основе рекомендаций ICSCRT. Клетки, выделенные по этому протоколу, можно рассматривать как мезенхимальные стволовые клетки для дальнейшего применения.

Abstract

Пульпа зуба человека представляет собой многообещающий мультипотентный резервуар стволовых клеток с выдающимися регенеративными компетенциями, которые могут быть получены из удаленного зуба. Экто-мезенхимальное происхождение стволовых клеток пульпы зуба (DPSC), полученное из нервного гребня, обеспечивает высокую степень пластичности, которая обусловлена их многогранными преимуществами в восстановлении и регенерации тканей. Существуют различные практические способы сбора, поддержания и пролиферации взрослых стволовых клеток, которые исследуются для их использования в регенеративной медицине. В данной работе мы демонстрируем создание первичной культуры мезенхимальных стволовых клеток из зубной ткани методом культивирования экспланта. Выделенные клетки имели веретенообразную форму и прилегали к пластиковой поверхности культуральной пластины. Фенотипическая характеристика этих стволовых клеток показала положительную экспрессию рекомендованных Международным обществом клеточной терапии (ISCT) маркеров клеточной поверхности для МСК, таких как CD90, CD73 и CD105. Кроме того, незначительная экспрессия гемопоэтических (CD45) и эндотелиальных маркеров (CD34) и менее 2% экспрессии маркеров HLA-DR подтвердили гомогенность и чистоту культур DPSC. Далее мы проиллюстрировали их мультипотентность, основанную на дифференциации на адипогенные, остеогенные и хондрогенные линии. Мы также заставили эти клетки дифференцироваться в печеночные и нейроноподобные клетки путем добавления соответствующих стимулирующих сред. Этот оптимизированный протокол поможет в культивировании расширяемой популяции мезенхимальных стволовых клеток для использования в лаборатории или для доклинических исследований. Подобные протоколы могут быть включены в клинические установки для практики лечения на основе DPSC.

Introduction

Взрослые стволовые клетки превратились в мощный терапевтический инструмент для клеточного лечения и терапии благодаря своей пластичности, паракринным механизмам и иммуномодулирующим свойствам ^1,2,3. Обнадеживающие данные доклинических исследований на основе стволовых клеток вдохновили исследователей на работу по переводу «от скамьи к постели больного». Тип стволовых клеток, используемых для терапии стволовыми клетками, играет важную роль в достижении успешных результатов. В доклинических и клинических исследованиях наиболее широко известным источником мезенхимальных стволовых....

Protocol

Все процедуры, описанные в исследовании, были одобрены Комитетом по этике института (IEC# 9195/PG-12 ITRG/2571-72) PGIMER, Чандигарх. Все эксперименты, связанные с клеточными культурами, должны проводиться в шкафу биологической безопасности класса II (BSC) в соответствии с асептическим методом. Пульпа зу?.......

Discussion

Стволовые клетки связывают надежды на излечение многих болезней благодаря своей пластичности, прочности, иммуномодулирующим свойствам, паракринным механизмам и эффективности самонаведения. Ткань пульпы зуба считается самым мощным и ценным источником стволовых клеток, обладающих вы.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 well cell culture plate	Costar	3516	For cell culture
Alcian blue stain	EZstain chondrocyte staining kit, HiMedia	CCK029
alizarin red S stain	Sigma-Aldrich	TMS-008	Osteogenic stain
Antibiotic cocktail	Himedia	A002-5X50ML	To prevent culture contamination
Ascorbic Acid	Himedia	TC094-25G	Chondrogenic induction
B27 supplement	Gibco	17504044	For neural induction
bFGF ( basic Fibroblast Growth Factor)	Gibco	PHG0024	For neural induction
CD 105	BD-Pharmingen	560839
CD 35	Biolegend	343604
CD 45	Biolegend	304006
CD 73	Biolegend	344016
CD 90	Biolegend	328107	Characterization
cetyl pyridinium chloride (CPC)	Sigma-Aldrich	1104006	For Alizarin Red extraction
Dexamethasone 21-phosphate disodium	Sigma-Aldrich	D1159-100MG
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Himedia	TS1006-5L	For washing purpose
EGF (Epidermal Growth Factor)	Gibco	PHG0311	For hepatic and neural  induction
EVOS LED microscope	Invitrogen		For  fluorescence imaging
EZ stain Chondrocyte staining kit	Himedia	CCK029-1KT	Chondro stain Kit
FACS Canto flow cytometer	BD Biosciences		For cell characterization
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	For primary culture
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442	For cell culture
G5 supplement	Gibco	17503012	For neural induction
HGF( Hepatocyte Growth Factor)	Sigma-Aldrich	H1404	For hepatic Induction
HLA-DR	Biolegend	307605
Human TGF-β3	Peprotech	#100-36E-10U
Insulin-Transferrin-Selenous acid premix	Sigma-Aldrich	I3146	For hepatic Induction
ITS premix	Corning	354350
LDL Uptake Assay kit	Abcam	ab133127	For hepatic characterization
Low glucose DMEM	Gibco	11885-084	For hepatic induction
MAP2 antibody	Sigma-Aldrich	M4403	For neural characterization
N2 supplement	Gibco	17502048	For neural induction
Neural Basal Media	Gibco	21103049	For neural induction
NFM antibody	Sigma-Aldrich	N4142	For neural characterization
Nikon Elipse TS100 microscope	Nikon		For  fluorescence imaging
Oil Red O	Sigma-Aldrich	01391-250Ml	Adipogenic stain
Oncostatin M	R&D Systems	295-OM-010/CF	For hepatic Induction
Petridish	Tarson	460090-90MM	For tissue cutting
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	15655-100G	Osteogenic induction
Propan-2-ol	Thermo Fisher	Q13827	For Oil Red O extraction
Sodium pyruvate solution	Sigma life sciences	S8636-100ML
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	For cell passaging
Whatman filter paper	merck	WHA1001325	filter paper
α- Minimum Essential Media (α-MEM)	Sigma-Aldrich	M0643-10X 1L	Media for primary culture
β-glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G9422-50G