Легкий имплантат привода для хронической записи тетрода у молодых мышей

Summary

Здесь мы описываем конструкцию микропривода, процедуру хирургической имплантации и стратегию послеоперационного восстановления, которые позволяют одновременно регистрировать хроническое поле и отдельные единицы из нескольких областей мозга у молодых и подростковых мышей в критическом окне развития с 20-го послеродового дня (p20) до 60-го дня (p60) и далее.

Abstract

Электрофизиология in vivo обеспечивает беспрецедентное понимание динамики цепей субсекундного уровня интактного мозга и представляет собой метод, имеющий особое значение для изучения мышиных моделей нервно-психических расстройств человека. Однако такие методы часто требуют больших черепных имплантатов, которые не могут быть использованы у мышей на ранних этапах развития. Таким образом, практически никаких исследований физиологии in vivo не проводилось на свободно ведущих себя младенцах или молодых мышах, несмотря на то, что лучшее понимание неврологического развития в этом критическом окне, вероятно, даст уникальное представление о возрастных нарушениях развития, таких как аутизм или шизофрения. Здесь описана конструкция микропривода, процедура хирургической имплантации и стратегия послеоперационного восстановления, которые позволяют одновременно регистрировать хроническое поле и отдельные единицы из нескольких областей мозга у мышей по мере их старения с 20-го послеродового дня (p20) до 60-го дня (p60) и далее, временное окно, примерно соответствующее человеческому возрасту от 2 лет до взрослой жизни. Количество регистрирующих электродов и конечных мест записи может быть легко изменено и расширено, что позволяет гибко контролировать экспериментальный мониторинг in vivo областей мозга, связанных с поведением или заболеванием, на протяжении всего развития.

Introduction

Мозг претерпевает масштабные изменения в критические периоды развития в детском и подростковом возрасте ^1,2,3. Многие неврологические и психические заболевания, включая аутизм и шизофрению, впервые проявляются поведенчески и биологически в этот период развития мозга у подростков и^{подростков 4,5,6}. Хотя многое известно о клеточных, синаптических и генетических изменениях, которые происходят на ранних этапах развития, сравнительно мало известно о том, как изменяются процессы на уровне цепей или сетей в течение этого временного окна. Важно отметить, что функция мозга на уровне цепи, которая в конечном итоге лежит в основе сложного поведения, памяти и познания, является непредсказуемым, эмерджентным свойством клеточной и синаптической функции 7,8,9,10. Таким образом, чтобы полностью понять функции мозга на сетевом уровне, необходимо непосредственно изучить нейронную активность на уровне интактной нейронной цепи. Кроме того, чтобы определить, как активность мозга изменяется на протяжении всего прогрессирования нервно-психических расстройств, крайне важно изучить сетевую активность в достоверной модели заболевания в течение определенного временного окна, когда проявляются поведенческие фенотипы заболевания, и отслеживать наблюдаемые изменения по мере их сохранения во взрослой жизни.

Одним из наиболее распространенных и мощных научных модельных организмов является мышь с большим количеством уникальных генетических штаммов, которые моделируют нарушения развития нервной системы с возрастным началом поведенческих и/или мнемонических фенотипов 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Несмотря на то, что сложно соотнести точные моменты развития между мозгом человека и мышей, морфологические и поведенческие сравнения показывают, что мыши p20-p21 представляют человеческий возраст 2-3 года, а мыши p25-p35 представляют человеческий возраст 11-14 лет, при этом мыши, вероятно, достигают эквивалента развития 20-летнего взрослого человека к p60^{3, 22}. Таким образом, чтобы лучше понять, как развивается ювенильный мозг, и определить, как нейронные сети мозга становятся дисфункциональными при таких заболеваниях, как аутизм или шизофрения, было бы идеально напрямую контролировать активность мозга in vivo у мышей в возрасте от 20 до 60 дней.

Тем не менее, фундаментальной проблемой в мониторинге активности мозга на ранних этапах развития у мышей является небольшой размер и относительная слабость молодых мышей. Хроническая имплантация электродов, которая необходима для лонгитюдных исследований развития мозга, обычно требует большого, громоздкого корпуса для защиты тонких электродных проводов и интерфейсных плат^23,24, а имплантаты должны быть прочно прикреплены к черепу мыши^, который тоньше и менее жесткий у молодых мышей из-за уменьшения окостенения. Таким образом, практически все исследования физиологии грызунов in vivo были проведены на взрослых людях из-за их относительного размера, прочности и толщины черепа. На сегодняшний день большинство исследований, изучающих физиологию мозга ювенильных грызунов in vivo, были проведены на крысах дикого типа, что обязательно ограничивает возможность экспериментального мониторинга функции мозга ювенильных особей в свободно ведущей модели расстройства человека 25,26,27,28,29,30.

В этой рукописи описывается новый корпус имплантата, процедура хирургической имплантации и стратегия послеоперационного восстановления для хронического изучения долгосрочной (до 4 и более недель) функции мозга in vivo молодых мышей в течение критического для развития временного окна (от p20 до p60 и далее). Процедура имплантации обеспечивает надежное, постоянное прикрепление электродов к черепам молодых мышей. Кроме того, конструкция микропривода легкая, так как этот микропривод весит ~ 4-6 г в полностью собранном виде, и из-за минимального уравновешивания, необходимого для компенсации веса имплантата, он не влияет на поведенческие характеристики молодых мышей во время типичных поведенческих парадигм.

Protocol

Настоящее исследование было одобрено Комитетом по уходу за животными и их использованию Юго-западного медицинского центра Техасского университета (протокол 2015-100867) и выполнено в соответствии с рекомендациями как учреждения, так и Национального института здравоохранения. Самцы и самки мышей C57/Bl6, использованные в настоящем исследовании, были имплантированы в p20 (вес 8,3-11,1 г на момент имплантации).

1. Проектирование и конструкция микропривода

1. Цифровое проектирование и печать микропривода (рис. 1)
   1. Загрузите шаблоны моделей микродисков (https://github.com/Brad-E-Pfeiffer/JuvenileMouseMicroDrive).
   2. Определите стереотаксические местоположения целевых областей мозга в соответствующем стереотаксическом атласе.
   3. Используя программное обеспечение для трехмерного автоматизированного проектирования (3D CAD), загрузите шаблон канюли микропривода (рис. 1B).
   4. При необходимости измените места выхода выходной канюли на модели канюли с микроприводом, чтобы нацелиться на нужные области мозга.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая экструзия отверстия канюли должна быть не менее 2 мм в длину, чтобы гарантировать, что тетрод выйдет из отверстия канюли, направленного прямо на цель. Шаблон канюли с микроприводом предназначен для двустороннего воздействия на переднюю поясную кору (один тетрод на полушарие), область гиппокампа CA1 (четыре тетрода на полушарие) и область гиппокампа CA3 (два тетрода на полушарие), при этом один эталонный тетрод на полушарие расположен в белом веществе над областью гиппокампа CA1.
   5. При необходимости модифицируйте корпус микропривода (рис. 1A) для размещения крепления платы электронного интерфейса (EIB).
   6. Распечатайте корпус микронакопителя, канюлю, конус и крышку с высоким разрешением на 3D-принтере (в идеале с разрешением лучше 25 мкм) и подготовьте печатные материалы в соответствии с протоколами производителя. Используйте смолы для принтеров с высокой жесткостью.
2. Сборка нестандартных винтов и креплений (рис. 2A, B)
   1. Используя программное обеспечение 3D CAD, загрузите модели винтовых креплений (рис. 1E).
   2. Распечатайте винтовые насадки с высоким разрешением на 3D-принтере (в идеале с разрешением не менее 25 мкм) и подготовьте печатные материалы в соответствии с протоколами производителя. Используйте смолы для принтеров с высокой жесткостью.
   3. Прикрепите винтовые крепления к каждому винту с продвижением тетрода (рис. 1F) (винты, продвигающие тетрод, изготавливаются по индивидуальному заказу в механическом цехе перед изготовлением микропривода).
      1. Прикрепите к каждому винту по два винтовых крепления, одно над коньком, а другое под гребнем. Убедитесь, что нижняя часть каждого винтового крепления соприкасается с гребнем. Скрепите винтовые насадки гелем цианоакрилатом.
      2. После крепления убедитесь, что винтовые крепления не перемещаются по продольной оси винта, а свободно вращаются с минимальным сопротивлением.
3. Сборка корпуса микропривода (рис. 2C, D)
   1. Тонкими, острыми ножницами разрежьте большие полиимидные трубки (наружный диаметр: 0,2921 мм, внутренний диаметр: 0,1803 мм) на секции длиной ~6 см.
   2. Пропустите большие полиимидные секции через выходные отверстия на канюле микропривода так, чтобы каждая трубка выходила за нижнюю часть канюли на несколько миллиметров.
   3. Используя чистую иглу 30 г, прикрепите полиимид к канюле, нанеся небольшое количество жидкого цианоакрилата. Следите за тем, чтобы цианоакрилат не попал внутрь полиимидной трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Капание жидкого цианоакрилата в канюлю через верхнюю часть корпуса привода может ускорить этот процесс, но позже потребует повторной очистки направляющих отверстий с помощью сверла с тонким наконечником.
   4. Пропустите большие полиимидные трубки из верхней части канюли микропривода через соответствующие большие полиимидные отверстия в корпусе микропривода.
   5. Медленно сдвиньте канюлю микропривода и корпус микропривода вместе, пока они не окажутся рядом и выступы крепления канюли/корпуса не сблокируются. Будьте осторожны, чтобы не перегнуть и не повредить полиимидные трубки в процессе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая полиимидная трубка должна плавно проходить от нижней части канюли через верхнюю часть корпуса микропривода. Небольшой изгиб является нормальным, но чрезмерный изгиб полиимидной трубки может деформировать тетрод и помешать его прохождению прямо в мозг.
   6. Соедините корпус микропривода и канюлю микропривода вместе с помощью цианоакрилата.
   7. Используя новое острое лезвие бритвы, отрежьте большие концы полиимидных трубок, которые выдавливаются из нижней части выходных отверстий канюли. Убедитесь, что разрез находится точно у основания канюли, чтобы трубки и дно канюли были на одном уровне друг с другом.
   8. Острыми ножницами разрежьте большую полиимидную трубку чуть выше края внутреннего обода корпуса привода под углом ~45°.
4. Загрузка собранных нестандартных винтов (рис. 2E)
   1. Вкрутите каждый собранный нестандартный винт во внешние отверстия корпуса микропривода. Убедитесь, что направляющая стойка винта проходит через большое отверстие в винтовых креплениях. Продвигайте каждый винт полностью, пока он не перестанет продвигаться дальше. Рекомендуется предварительно смазывать винты минеральным маслом или консистентной смазкой для осей.
   2. Используя очень острые ножницы, разрежьте небольшие полиимидные трубки (внешний диаметр: 0,1397 мм, внутренний диаметр: 0,1016) на секции длиной ~ 4 см.
   3. Пропустите небольшие полиимидные секции через большие полиимидные трубки, уже установленные в микроприводе. Убедитесь, что излишки небольших полиимидных трубок выступают сверху и снизу каждой большой полиимидной трубки.
   4. Прикрепите маленькие полиимидные трубки к винтовым насадкам с помощью цианоакрилата, стараясь не допускать попадания цианоакрилата ни в большие, ни в маленькие полиимидные трубки.
   5. Используя новое острое лезвие бритвы, отрежьте маленькие концы полиимидных трубок, которые выдавливаются из нижней части отверстий канюли. Убедитесь, что разрез находится точно у основания канюли и что разрез чистый, и ничто не блокирует отверстие полиимидной трубки.
   6. Острыми ножницами отрежьте верхнюю часть маленького полиимида на несколько миллиметров выше верхней части винтового крепления под углом ~45°. Убедитесь, что разрез чистый, ничто не блокирует отверстие полиимидной трубки.
5. Загрузка тетродов
   1. Подготовьте тетроды (~6 см в длину), используя ранее описанные способы³¹.
   2. Используя щипцы с керамическими или резиновыми наконечниками, осторожно пропустите тетрод через одну из маленьких полиимидных трубок, оставив ~ 2 см выступающим из верхней части маленькой полиимидной трубки.
   3. Прикрепите тетрод к верхней части небольшой полиимидной трубки с помощью жидкого цианоакрилата, стараясь не соединять маленькие и большие полиимидные трубки вместе в процессе.
   4. Втяните винт до тех пор, пока он не окажется в верхней части диска.
   5. Возьмитесь за тетродную проволоку, выступающую из нижней части привода, и осторожно перегибайте ее в том месте, где она выходит из канюли.
   6. Полностью вставьте винт обратно в диск.
   7. Используя очень острые ножницы, отрежьте тетродную проволоку чуть выше излома. Под микроскопом убедитесь, что срез чистый и что металл всех четырех тетродов обнажен.
   8. Втяните винт до тех пор, пока тетрод не закрепится внутри канюли.
   9. Повторите шаги 1.5.2-1.5.8 для всех винтов.
   10. Прикрепите EIB к опорной платформе EIB с помощью небольших ювелирных винтов.
   11. Подключите каждый электрод каждого тетрода к соответствующему порту на EIB.
6. Подготовка микронакопителя к операции
   1. Электрически пластинчатые тетроды для уменьшения электрического импеданса используют ранее описанные способы³¹.
   2. После нанесения покрытия убедитесь, что каждый тетрод размещен в канюле таким образом, чтобы кончик тетрода находился на одном уровне с дном каждого отверстия канюли.
   3. Сдвиньте конус микропривода вокруг готового микропривода. Прикрепите крышку микропривода к конусу микропривода, вставив полюс крепления конуса в порт крышки.
   4. Сориентируйте конус так, чтобы разъемы EIB свободно проходили через сквозные отверстия соединения EIB, когда крышка закрыта, и приклейте конус на место цианоакрилатом, расположенным вокруг основания конуса, следя за тем, чтобы цианоакрилат не попал ни в одно из выходных отверстий канюли. Снимите крышку.
   5. Тщательно заполните каждое отверстие канюли стерильным минеральным маслом, чтобы предотвратить попадание биологических жидкостей в полиимидные отверстия после хирургической имплантации.
   6. Тщательно смажьте основание канюли стерильным вазелином. Это послужит барьером для предотвращения попадания химических агентов (например, стоматологического цемента) в открытый мозг во время операции.
   7. Взвесьте полностью собранный микропривод, крышку и четыре костяных винта, чтобы получить равновесный противовес.
   8. При желании, перед операцией, выдавите тетроды на расстоянии, подходящем для достижения целевых областей мозга, как только диск окажется на одном уровне с черепом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед хирургической имплантацией стерилизуйте имплантат с помощью газовой стерилизации в оксиде этилена (500-1200 мг / л, 2-4 часа).  Все костные винты и хирургические инструменты должны быть стерилизованы в автоклаве (121 ° C, 30 минут).

2. Хирургическая имплантация

1. Обезболивание мыши и установка ее в стереотаксический аппарат
   1. Поместите мышь в небольшую коробку с достаточным пространством для перемещения и обезболите мышь 3-4% изофлураном.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать другие анестетики, но следует соблюдать осторожность из-за возраста, размера и веса молодого мыши.
   2. Как только мышь перестает реагировать (нет реакции на защемление хвоста, скорость вентиляции ~ 60 вдохов в минуту), выньте ее из коробки и быстро установите на стереотаксический аппарат.
   3. Быстро наденьте стереотаксическую маску на морду мыши и поддерживайте анестезию на уровне 1-3% изофлурана. Нанесите любое одобренное ветеринарами обезболивающее, такое как бупренорфин с замедленным высвобождением (0,05-0,5 мг / кг подкожно) или противовоспалительные средства, такие как карпрофен (5-10 мг / кг подкожно), до первоначального хирургического разреза.
   4. Полностью закрепите голову мыши в стереотаксическом аппарате с помощью амбушюр. Убедитесь, что череп ровный и неподвижный, не оказывая ненужного давления на ушные каналы мыши. Из-за ограниченного окостенения ювенильных костей черепа возможно необратимое повреждение во время фиксации головы.
2. Подготовка мыши к операции и обнажение черепа
   1. Защитите глаза мыши, нанеся небольшой объем синтетического слезного геля на каждый глаз и покрыв каждый глаз автоклавным пластырем фольги.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Синтетические слезы сохранят глаза влажными, в то время как фольга предотвратит долгосрочное повреждение любого источника света. Предпочтительны более густые синтетические слезные растворы, поскольку они также могут служить барьером для непреднамеренного введения других потенциально токсичных хирургических растворов (этанола, стоматологического акрила и т. д.) в глаза.
   2. Используя стерильные ватные тампоны, нанесите крем для удаления волос на операционную область, чтобы удалить волосы с кожи головы. Будьте осторожны, чтобы крем не попал в глаза. После удаления волос наденьте стерильную драпировку на кожу головы, чтобы закрепить операционную область.
   3. Используя стерильные тампоны с ватными наконечниками, очистите кожу головы тремя последовательными промывками раствором повидон-йода (10%), а затем изопропиловым спиртом (100%).
   4. С помощью стерильного скальпеля или тонких ножниц удалите кожу головы.
   5. Используя стерильные ватные тампоны и стерильные растворы физиологического раствора (0,9% NaCl) и перекиси водорода, тщательно очистите череп.
   6. Определите брегму и, используя стереотаксический аппарат, тщательно отметьте перманентным маркером целевые места записи на черепе.
3. Открытие отверстия канюли и прикрепление костных якорей
   1. Удалите череп, накладывая места записи. # Из-за тонкости черепа в этом возрасте разрезают череп лезвием скальпеля; Это устраняет необходимость использования дрели, которая может повредить нижележащую твердую мозговую оболочку. Держите открытую твердую мозговую оболочку влажной с помощью стерильного физиологического раствора (0,9% NaCl) или стерильного минерального масла. Не удаляйте и не прокалывайте твердую мозговую оболочку на этом этапе, так как у молодых мышей она достаточно тонкая, чтобы тетроды могли пройти через нее на будущих этапах.
   2. Тщательно просверлите пилотные отверстия для четырех костяных шурупов.
      1. Поместите костные винты в крайние боковые и ростральные или каудальные части черепа, где кость самая толстая, а костные винты находятся достаточно далеко от имплантата микропривода. Для костных винтов используйте стерильные ювелирные винты (например, резьба UNM 120, головка 1.5 мм).
      2. Плотно намотайте один костный винт тонким проводом с высокой проводимостью, который будет служить заземлением и будет прикреплен к EIB на шаге 2.4.6.
   3. С помощью лезвия скальпеля или осторожно с помощью сверла забейте череп рядом с местами отверстий для костяных винтов. Скоринг важен для обеспечения достаточно шероховатой поверхности для связывания жидкого цианоакрилата на этапе 2.3.5.
   4. Используя стерильную отвертку и стерильный винтовой зажим, вставьте каждый стерильный костный винт на место, стараясь не проткнуть нижележащую твердую мозговую оболочку.
   5. Используя стерильную иглу весом 30 г, поместите жидкий цианоакрилат вокруг каждого костного винта. Это эффективно утолщает череп, к которому прикреплены костные винты. Следите за тем, чтобы цианоакрилат не попадал в открытую твердую мозговую оболочку над местами записи.
4. Опускание и крепление микропривода (рис. 2G)
   1. Установите готовый микропривод на стереотаксический аппарат, который будет осторожно опущен на череп мыши. Убедитесь, что канюля микропривода будет находиться в соответствующих координатах при опускании.
   2. Опускайте микропривод медленно, двигаясь только в дорсальном/вентральном направлении. Опустите микропривод с тетродами, уже выдвинутыми из отверстий канюли (шаг 1.6.6), чтобы визуализировать их вход в мозг; Любое медиальное/латеральное или ростральное/каудальное движение, когда тетроды касаются мыши, может согнуть тетроды и привести к тому, что они пропустят свой конечный пункт назначения.
   3. После того, как микропривод полностью опущен, убедитесь, что основание канюли соприкасается с черепом/твердой мозговой оболочкой. Слой вазелина и/или минерального масла будет служить барьером для покрытия открытой твердой мозговой оболочки. При необходимости добавьте стерильный вазелин или стерильный костный воск, чтобы покрыть излишки обнаженной твердой мозговой оболочки.
   4. Удерживая микропривод на месте с помощью стереотаксического аппарата, покройте череп зубным цементом, чтобы прикрепить основание микропривода к имплантированным костным винтам.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стоматологический цемент должен полностью покрывать все костные винты и должен закрывать выступ анкерного зубного цемента на канюле микропривода.
   5. Пока зубной цемент схватывается, тщательно придайте ему форму, чтобы предотвратить острые углы или края, которые могут повредить мышь или повредить микродиск. Убедитесь, что стоматологического цемента достаточно для удержания микропривода, но исключите излишний стоматологический цемент, который добавит ненужный вес.
   6. Осторожно проденьте заземляющий провод через микропривод и прикрепите его к соответствующему слоту на EIB.
   7. Как только зубной цемент полностью застынет, осторожно отсоедините микропривод от стереотаксического аппарата. Установите крышку на микропривод.
   8. Стерильным ватным тампоном и стерильным физиологическим раствором очистите мышь.
   9. Стерильным ватным тампоном нанесите тонкий слой мази с антибиотиком на любую открытую кожу головы рядом с местом имплантации.
   10. Снимите фольгу с глаз мыши.
   11. Извлеките мышь из стереотаксического аппарата, позаботившись о том, чтобы выдержать дополнительный вес микропривода, когда мышь транспортируется в чистую клетку.

3. Послеоперационное восстановление

1. Немедленное выздоровление
   1. Перед операцией подготовьте систему противовеса, подключив трубу из ПВХ диаметром 0,75, как показано на рисунке 2G. Один рычаг системы проходит через отверстия, просверленные в крышке клетки, второй рычаг опирается на верхнюю часть крышки клетки, а третий рычаг выходит над клеткой и за ее пределы. Крайняя верхняя рука закрыта.
   2. Аккуратно прикрепите микропривод к системе противовесов (рис. 2G-I) и используйте противовес, идентичный весу микропривода и костных винтов. Проведите прочную нить или леску от разъема, прикрепленного к EIB, через три рычага системы противовеса к грузу противовеса, который висит над самым верхним рычагом.
   3. Убедитесь, что противовес надежно подключен к EIB микропривода и что имеется достаточная линия, чтобы дать мыши полный доступ ко всей клетке.
   4. Добавьте богатый питательными веществами гель в клетку вместе с увлажненным нормальным кормом для грызунов, чтобы обеспечить регидратацию и восстановление.
   5. Следите за мышью до тех пор, пока она полностью не оправится от хирургической анестезии.
2. Долгосрочное восстановление
   1. В любое время, когда микропривод не подключен к записывающему оборудованию, убедитесь, что микропривод поддерживается системой противовеса. Со временем уменьшайте противовес, но никогда не снимайте его полностью, чтобы избежать непредвиденной нагрузки на мышь или крутящего момента на костяные винты.
   2. Чтобы предотвратить повреждение имплантата и системы противовеса, разместите мышь без возможности прямого взаимодействия с другими мышами на время эксперимента.
   3. Обеспечьте богатый питательными веществами гель в течение как минимум 3 дней после операции, после чего будет достаточно одной твердой пищи.
      1. Из-за требований к накладным расходам системы противовесов не подавайте еду и воду в воздушную проволочную сетку; Положите еду на пол клетки и подайте воду через стенку клетки. Чтобы предотвратить порчу, полностью заменяйте продукты ежедневно.
   4. Ежедневно следите за тем, чтобы мышь имела свободный доступ ко всей клетке, а противовес надежно и прочно прикреплен к микродиску.

Discussion

Современные эксперименты, изучающие функцию нейронных цепей in vivo у грызунов, часто используют внеклеточную электрофизиологию с помощью постоянно имплантированных электродов для мониторинга активности отдельных нейронов (т. е. отдельных единиц) или локальных популяций (через локальные полевые потенциалы, LFP), но такие методы редко применяются к молодым мышам из-за технических проблем. В этой рукописи описывается метод получения in vivo электрофизиологических записей у мышей в критических для развития окнах от p20 до p60 и далее. Эта методология включает в себя производственный процесс для печати и изготовления имплантата с микроприводом, процедуру хирургической имплантации и стратегию послеоперационного восстановления, все из которых специально разработаны для использования на молодых мышах. Несколько соображений оказали влияние на разработку этого протокола, в том числе небольшой размер и относительная слабость молодых мышей по сравнению с их взрослыми собратьями, а также уменьшенное окостенение черепа ювенильной мыши, к которому необходимо было прикрепить микропривод.

Двумя основными методами, обычно используемыми для электрофизиологии in vivo , являются массивы электродов (например, тетроды) и кремниевые зонды. Кремниевые зонды имеют малый вес, могут обеспечить большое количество мест записи на единицу веса и ранее использовались у молодых крыс²⁵. Тем не менее, кремниевые зонды относительно дороги за единицу. Напротив, микропривод, описанный в этой рукописи, может быть изготовлен с использованием сырья стоимостью менее 50 долларов США, что делает его экономически эффективным вариантом для записи in vivo . Кроме того, кремниевые зонды часто должны быть имплантированы в фиксированные линии, что запрещает регистрацию пространственно разнообразных областей мозга. В отличие от этого, конструкция микропривода, описанная в этой рукописи, использует независимо регулируемые тетроды для одновременной записи в 16 различных местах практически без ограничений пространственных отношений между этими местами. Эта конструкция микропривода может быть легко изменена, чтобы обеспечить нацеливание на места, отличные от описанных здесь, путем перемещения отверстий канюли в любое желаемое переднее/заднее и медиальное/дистальное расположение. При нацеливании на альтернативные области мозга важно отметить, что, хотя тетроды часто движутся прямо, эти тонкие провода могут слегка отклоняться, когда они выходят из канюли микропривода. Таким образом, чем меньше или вентральнее область мозга, тем сложнее будет успешно нацелиться на область с помощью тетродов.

Имплантат микропривода, описанный в данной рукописи, принципиально аналогичен нескольким предыдущим конструкциям микроприводов на основе тетродов 23,32,33,34,35 в том, что отдельные тетроды прикреплены к винтам^, что позволяет точно контролировать глубину записи каждого тетрода. Несмотря на то, что некоторые особенности современной конструкции микропривода уникальны, в том числе простота нацеливания на пространственно распределенные области мозга, основной новизной данной рукописи является описание стратегий хирургической имплантации и послеоперационного восстановления, которые позволяют проводить хронические исследования сетевой активности у все еще развивающихся молодых мышей. Действительно, описанные здесь методы хирургии и восстановления могут быть адаптированы для поддержки других имплантатов у молодых мышей.

Чтобы поддерживать последовательную запись в течение нескольких дней, провода или зонды должны быть жестко прикреплены к черепу. В то время как общая структура черепа мыши претерпевает лишь незначительные изменения после p20, череп значительно утолщается между p20 и p45³⁶. Действительно, череп на p20 недостаточно жесткий, чтобы поддерживать прикрепленный имплантат без повреждения. Чтобы преодолеть это биологическое ограничение, этот протокол искусственно утолщает череп с помощью цианоакрилата во время операции по имплантации. Имплантация мышам моложе p20, вероятно, возможна с использованием этой стратегии, но череп мыши претерпевает значительные изменения в размерах и форме примерно до p20³⁶. Таким образом, имплантация в течение длительных периодов времени у мышей моложе p20 не рекомендуется, поскольку цианоакрилат и фиксированные костные винты в все еще развивающемся черепе могут значительно повлиять на естественный рост черепа и развитие основной ткани мозга. Важно отметить, что в этом исследовании не наблюдалось никакого влияния на общие размеры черепа или размера мозга после хронической имплантации, начиная с p20 (рис. 5C).

Важнейшим шагом в методе, описанном в этой рукописи, является стратегия послеоперационного восстановления; Согласно этой стратегии, вес имплантата должен постоянно уравновешиваться по мере взросления мыши и развития мышечной и опорно-двигательной системы. В начале после имплантации мыши не могут успешно переносить вес имплантата без противовеса, что приводит к недоеданию и обезвоживанию, поскольку мышь не может адекватно добраться до источников пищи и воды в своей клетке. Система противовеса проста и недорога в строительстве, тривиальна в реализации и позволяет мышам любого имплантируемого возраста свободно исследовать всю свою домашнюю клетку, тем самым обеспечивая адекватное питание и гидратацию. По мере старения мышей количество противовеса может быть уменьшено до тех пор, пока оно не будет полностью удалено у взрослых мышей; Тем не менее, рекомендуется продолжать использовать систему противовесов на протяжении всего эксперимента, по крайней мере, с номинальным противовесом, прикрепленным в любое время. В то время как взрослая мышь может быть в состоянии выдержать размер и вес микропривода с течением времени, непрерывное естественное движение во время свободного поведения без улучшающего противовеса создает крутящий момент и силу сдвига на костных винтах, которые закрепляют микродиск на черепе, что делает его все более вероятным, особенно во время более длительных хронических экспериментов.

В настоящем исследовании следует отметить два важных ограничения. Во-первых, чтобы оценить влияние имплантации в p20 на развитие черепа и мозга, несколько когорт мышей были принесены в жертву после длительной имплантации (рис. 5C). Хотя эти анализы не выявили существенного влияния имплантации на размер полости черепа или массу мозга (рис. 5C), в текущем исследовании не изучался размер черепа или масса мозга в несколько временных точек на протяжении раннего периода развития p20-p60. В то время как предыдущая работа показывает, что развитие полости мозга завершается к p20³⁶, возможно, что имплантация в это раннее окно может привести к непредвиденным изменениям, которые корректируются или компенсируются взрослым возрастом, который был оценен здесь. Во-вторых, эксперименты, в результате которых были получены электрофизиологические данные, показанные на рисунках 3 и 4 , не были направлены на максимизацию выхода клеток. Таким образом, хотя представленные здесь данные демонстрируют стабильные, хронические записи и хорошо изолированные единичные единицы, их не следует воспринимать как репрезентативные для максимального потенциального выхода для этого устройства.

Многие неврологические и психические расстройства человека проявляются в периоды раннего развития или в подростковом возрасте, включая аутизм и шизофрению. Тем не менее, мало что известно о дисфункции на уровне цепи, которая может лежать в основе этих заболеваний, несмотря на множество доступных моделей мышей. Идентификация этих первоначальных изменений сети имеет решающее значение для создания стратегий раннего выявления и парадигм лечения. Тем не менее, из-за технических проблем остается неясным, как сетевая функция нарушается при разработке в мышиных моделях нервно-психических заболеваний. Описанная здесь стратегия микродрайва и восстановления предназначена для поддержки исследований развития мультирегиональной мозговой сети в мозге мыши и, таким образом, позволяет исследователям измерять здоровое развитие мозга, а также выявлять изменения в этом развитии в мышиных моделях заболеваний.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 V video tracking LEDs	Neuralynx	HS-LED-Red/Green-omni-10V	For use with headstage pre-amplifiers that contain LED sockets for movement tracking purposes
16TT EIB Board	Neuralynx	EIB-36-16TT	Electronic interface board- omnetics connector
16TT headstage pre-amplifier	Neuralynx	HS-36-LED	Omnetics 44 socket signal amplifier between EIB board and tether cable for recording applications; includes connectors for headstage LEDs for movement tracking purposes
Baby-Mixter hemostat	FST	13013-14	Fine curved hemostat
Bone anchor screw	Stoelting	51457	Used to attach EIB board to main drive body
Burpenorphine	ZooPharm	Lot #BERLAB0.5-221207	Burpenorphine (0.5 mg/mL) 5mL quantity
Cable tether	Neuralynx	HS-36 Litz Tether	Lightweight shielded wire tether for omnetics headstages; length options of 1 m/2 m/3 m/5 m
Carprofen/Rimadyl	Bio-Serve	MD150-2	Post-operative anti-inflammatory agent
Clear resin v4	Formlabs	FLGPGR04	Liquid resin that is photopolymerized by 3D printer during the 3D printing process
Custom (shuttle) screw	Advanced Machining and Tooling, Inc.	Custom	Machined and threaded custom screws
Dental acrylic liquid component	Teets denture material	Lot# 329801	liquid  component of denture material (see above)
Dental acrylic powder component	Teets denture material	Lot# 583987	"cold cure" denture material, methyl methacrylate; mixed with liquid component for application to secure recording device in place
DietGel Boost	ClearH2O	72-04-5022	High calorie dietary supplement for young/recovering mice
Digital Lynx 16SX	Neuralynx	DigitalLynx 16SX Base	Main recording apparatus with 16 combo board slots for up to 512 recording channels
Dissector scissors- heavy blades	FST	14082-09	Various
Dumont #5 ceramic coated forceps	FST	11252-50	Tetrode handling/threading/pinning
Dumont #5SF forceps	FST	11252-00	Multipurpose assembly use
Dumont #5SF forceps	FST	11252-00	Multipurpose surgical use
Dumont #7 fine forceps (curved)	FST	11274-20	Various
Dumont #7 fine forceps (curved)	FST	11274-20	Multipurpose surgical use
EIB-36 plating adapter	Neuralynx	EIB-36 plating adapter	Plating/assembly use
EIB-36 plating adapter	Neuralynx	EIB-36 plating adapter	Stereotactic accessory for lowering drive onto skull during surgery
Euthasol	Virbac	710101	Pentobarbital sodium for euthanasia
Extra fine Bonn scissors	FST	14083-38	Various
Extra fine graefe forceps	FST	11150-10	Small straight serrated forceps
Extra fine graefe forceps	FST	11150-10	Small straight serrated forceps
Fine hemostats	FST	13006-12	Fine hemostats
Fine scissors- CeramaCut	FST	14958-09	Tetrode cutting
Fine scissors- ToughCut	FST	14058-09	Various
Form 3+	Formlabs	PKG-F3-P-WS-SVC-BASIC	3D printer for fabrication of all printed parts/materials; low-force stereolithography 3D printer (LFS)
Gel super glue	Loctite	1363589	Various steps
Graefe forceps	FST	11049-10	Small angled serrated forceps
Ground wire	A-M Systems	Lot# 582335	Stainless steel bare wire, .005" diameter, annealed, 100 feet
Hair removal gel	Generic	Commercially available	For pre-op removal of hair from top of mouse head
Heat gun	Dewalt	D26960K	Tetrode fusion following spinning
High temperature cautery kit	FST	18010-00	For use with bone wax if applicable
Hot bead sterilizer	FST	18000-45	Electrical sterilization apparatus for ad hoc instrument sterilization during surgical procedures
Isoflurane	Covetrus	11695067771	Standard isoflurane liquid anesthsia for use in isoflurane vaporizer to max 5%
Isopropyl alcohol 91%	Generic	Commercially available	For standard pre-operative sterilization procedure
Jewelry screw (bone screws for juvenile mice)	Component supply co.	MX-000120-02SFL	S/S machine screw #000-120 x 1/8'' filister head, slotted drive
LaGrange scissors	FST	14173-12	Various
Large polyimide tubing	Nordson medical	Lot # 13564	Polyimide tubing- inner diameter 0.0071"; outer diameter 0.0115"; length 36"
Liquid super glue	Loctite	1365882	Various steps
Micro drill	Foredom	K.1070	K.1070 high speed rotary micromotor kit; with control box, 3/32" collet, variable speed foot control, handpiece cradle; stereotactically fittable; 100–115 V use
Micro drill burr (0.5 mm+)	FST	19007-05/07/09	Craniotomy
Mineral oil	Sigma	Pcode 1002076577; M5904-500mL	Various steps
Mineral oil	Sigma	Pcode 1002076577; M5904-500mL	For use keeping craniotomy holes open
Miniature flathead screwdriver	FST	30051-10	Insertion/tightening of bone screws
Neosporin Triple Antibiotic Ointment	Johnson & Johnson	512373700	Antibiotic ointment
Omnetics 44 socket nano connector	Neuralynx	Neuralynx part #A70427-801	NONSTANDARD ITEM- omnetics 44 socket (female) dual row straight leg nano connector with 2 guide pins (male) for use with custom-made counterbalance apparatus
Platinum 10% iridium wire	California fine wire	MO# M374710	Fine recording wire spun into tetrodes for use during recording by use of the terode assembly station and spinner 2.0 (see below); HML NATRL VG BOND COAT; SIZE .0007 X 200FT
Platinum black plating solution	Neuralynx	Platinum black plating solution	Plating
Polycarbonate cage bottom	Thomas Scientific/Maryland plastics	1113M35; mfr. No. E0270	Standard cage bottom; can be fitted with wire mesh apparatus over top that contains chow+water bottle for unimplanted mice
Polycarbonate cage top with N10 micro filter	Ancare	N/A	Standard cage top to be modified with PVC pipe for counterbalance apparatus
Povidone iodine 10%	Generic	Commercially available	For standard pre-operative sterilization procedure
PVC pipe	Charlotte pipe	N/A	1/2" x 600 PSI schedule 40 white PVC pipe; for use/assembly into counterbalance apparatus during mouse recovery
Scalpel blades- #4	FST	10060-00	Incision use
Scalpel handle- #4 gross anatomy	FST	10060-13	Incision use
Self-holding pin and bone screw forceps	FST	26100-00	Holder for bone and ground screws while inserting into skull
Small EIB pins	Neuralynx	Small EIB pins	Attachment of tetrode wires to EIB board
Small polyimide tubing	Nordson medical	Lot # 19102423	Polyimide tubing- inner diameter 0.004''; outer diameter 0.0044''; length 36"
SolidWorks	Dassault Systemes	SolidWorks	3D CAD program for micro-drive design
Spatula and probe	FST	1090-13	Applicator for petroleum jelly/mineral oil + optional use for ad hoc tetrode straightening
Spring scissors- 8 mm	FST	15024-10	Scissors for cranial tissue incisions
Spring scissors- 8 mm	FST	15024-10	Initial incisions
Standard pattern forceps	FST	11000-12	Large serrated forceps
Surgical scissors- sharp-blunt	FST	14001-12	Various
Surgical scissors- ToughCut	FST	14054-13	Various
Tetrode assembly station	Neuralynx	Tetrode assembly station	Tetrode Assembly
Tetrode spinner 2.0	Neuralynx	Tetrode spinner 2.0	Tetrode Assembly
Two-part epoxy	Gorilla brand	4200102	Various steps