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* These authors contributed equally
Apresentamos aqui o desenvolvimento para a aquisição consistente de cortes criostato de gânglio da raiz dorsal de alta qualidade.
Cortes de criostato de alta qualidade do gânglio da raiz dorsal de camundongos (DRG) são cruciais para a coloração imunoquímica adequada e estudos de RNAscope na pesquisa de dor inflamatória e neuropática, coceira, bem como outras condições neurológicas periféricas. No entanto, continua sendo um desafio obter consistentemente seções de criostato de alta qualidade, intactas e planas em lâminas de vidro devido ao tamanho minúsculo da amostra do tecido DRG. Até o momento, não há nenhum artigo descrevendo um protocolo ideal para criossecção DRG. Este protocolo apresenta um método passo-a-passo para resolver as dificuldades frequentemente encontradas associadas à criossecção DRG. O artigo apresentado explica como remover o líquido circundante das amostras de tecido DRG, colocar as seções DRG na lâmina voltadas para a mesma orientação e achatar as seções na lâmina de vidro sem se curvar. Embora este protocolo tenha sido desenvolvido para a criossecção de amostras DRG, ele pode ser aplicado para a criossecção de muitos outros tecidos com um pequeno tamanho amostral.
O gânglio da raiz dorsal (DRG) contém os neurônios sensoriais primários, os macrófagos teciduais e as células satélites que circundam os neurônios sensoriais primários 1,2,3,4. É uma estrutura anatômica chave no processamento de sinais inócuos e nocivos, e desempenha papéis críticos na dor, prurido e vários distúrbios dos nervos periféricos 5,6,7,8,9,10,11,12,13.
Para o presente estudo, os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UCSF e conduzidos de acordo com o NIH Guide for the Care and Use of Laboratory animals. Camundongos adultos C57BL/6 machos e fêmeas (criados internamente) com 8-12 semanas de idade foram usados aqui.
1. Preparação da amostra DRG
O presente estudo coletou cerca de 16 seções DRG contínuas e de alta qualidade de um camundongo L4 DRG. Os cortes obtidos foram sem distorção. A Figura 1 mostra o passo a passo para a criossecção. A retirada de líquido extra dos cortes teciduais é mostrada na Figura 2. O processo de inclusão dos tecidos pela OCT é destacado na Figura 3. A Figura 4 mostra o posicionamento adequado das seções.......
Este protocolo fornece um procedimento passo-a-passo fácil para a secção criostato do DRG do mouse para obter seções DRG de alta qualidade em lâminas de forma confiável. Há quatro etapas críticas neste protocolo. Primeiro, a amostra DRG e a pinça devem estar secas antes de colocar a amostra DRG na OCT base. Qualquer líquido ao redor da amostra DRG formará uma camada de gelo ao seu redor, resultando em seções DRG se separando da OCT e curvando-se. Em segundo lugar, se o bloco de alumínio não tiver uma marc.......
Nenhum.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Avertin | Sigma-Aldrich | T48402-25G | Anesthetize animal |
Epredia Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm dia. Crosshatched | Fisherbrand | 1910 | Hold the OCT section at the bottom |
Ergo Tweezers | Fisherbrand | S95310 | Using the end of a tweezer to gently touch the bottom (6 o’clock) of the section so that it sticks to the platform surface to prevent the section from curving back in a roll |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 1255015 | To collect the DRG section |
Marking pens | Fisherbrand | 133794 | Mark the orientation of base OCT |
Scigen Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisherbrand | 23730571 | Embedding medium for frozen tissue specimens to ensure optimal cutting temperature (O.C.T.). |
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