מחקר זה נתמך במשותף על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (U1904116).

כל הנהלים אושרו ובוצעו בהתאם לסטנדרטים האתיים של ועדת הטיפול בבעלי חיים של האוניברסיטה החקלאית של הנאן (מחוז הנאן, סין).
1. תרבית תאי הפטוציטים של בקר
<ol><li>הפשיר את תאי הפטוציטים העיקריים17 ואת הצנטריפוגה 400 x גרם במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: תא...

הדמיית תאים חיים של גודל טיפות שומנים ואיחוי באמצעות שמן אדום O ו- BODIPY

<ol>
	<li>Fujimoto, T., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Not+just+fat:+the+structure+and+function+of+the+lipid+droplet.">Not just fat: the structure and function of the lipid droplet.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), 004838 (2011).</li><li>Grasselli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+non-alcoholic+fatty+liver+disease+and+potential+translational+value:+The+effects+of+3,5-L-diiodothyronine.">Models of non-alcoholic fatty liver disease and potential translational value: The effects of 3,5-L-diiodothyronine.</a> Annals of Hepatology. 16 (5), 707-719 (2017).</li><li>Herdt, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ruminant+adaptation+to+negative+energy+balance:+Influences+on+the+etiology+of+ketosis+and+fatty+liver.">Ruminant adaptation to negative energy balance: Influences on the etiology of ketosis and fatty liver.</a> Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 16 (2), 215-230 (2000).</li><li>Pino-de la Fuente, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+regulation+of+hepatic+lipid+droplet+metabolism.">Exercise regulation of hepatic lipid droplet metabolism.</a> Life Sciences. 298, 120522 (2022).</li><li>O'Connor, D., Byrne, A., Berselli, G. B., Long, C., Keyes, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mega-stokes+pyrene+ceramide+conjugates+for+STED+imaging+of+lipid+droplets+in+live+cells.">Mega-stokes pyrene ceramide conjugates for STED imaging of lipid droplets in live cells.</a> Analyst. 144 (5), 1608-1621 (2019).</li><li>Gao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+lipid+droplet+fusion+and+growth+by+CIDE+family+proteins.">Control of lipid droplet fusion and growth by CIDE family proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1197-1204 (2017).</li><li>T&#252;t&#252;nc&#252; Konyar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+insoluble+polysaccharides+and+neutral+lipids+in+the+developing+anthers+of+an+endangered+plant+species,+Pancratium+maritimum.">Dynamic changes in insoluble polysaccharides and neutral lipids in the developing anthers of an endangered plant species, Pancratium maritimum.</a> Plant Systematics and Evolution. 304, 397-414 (2018).</li><li>Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+BODIPY+(493/503)+to+visualize+intramuscular+lipid+droplets+in+skeletal+muscle.">Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 598358 (2011).</li><li>Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+neutral+lipids+by+oil+red+O+for+analyzing+the+metabolic+status+in+health+and+disease.">Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1149-1154 (2013).</li><li>Diaz, G., Melis, M., Batetta, B., Angius, F., Falchi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophobic+characterization+of+intracellular+lipids+in+situ+by+Nile+Red+red/yellow+emission+ratio.">Hydrophobic characterization of intracellular lipids in situ by Nile Red red/yellow emission ratio.</a> Micron. 39 (7), 819-824 (2008).</li><li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synthesis+of+polarity-sensitive+fluorescent+dyes+based+on+the+BODIPY+chromophore.">The synthesis of polarity-sensitive fluorescent dyes based on the BODIPY chromophore.</a> Dyes and Pigments. 89 (3), 217-222 (2011).</li><li>Rumin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescent+Nile+red+and+BODIPY+for+lipid+measurement+in+microalgae.">The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae.</a> Biotechnology for Biofuels. 8, 42 (2015).</li><li>Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+fluorescent+probes+for+lipid+droplets.">Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets.</a> Materials. 11 (9), 1768 (2018).</li><li>Raboisson, D., Mouni&#233;, M., Maign&#233;, &. #. 2. 0. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diseases,+reproductive+performance,+and+changes+in+milk+production+associated+with+subclinical+ketosis+in+dairy+cows:+A+meta-analysis+and+review.">Diseases, reproductive performance, and changes in milk production associated with subclinical ketosis in dairy cows: A meta-analysis and review.</a> Journal of Dairy Science. 97 (12), 7547-7563 (2014).</li><li>Ospina, P. A., Nydam, D. V., Stokol, T., Overton, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+of+elevated+nonesterified+fatty+acids+and+&#946;-hydroxybutyrate+concentrations+with+early+lactation+reproductive+performance+and+milk+production+in+transition+dairy+cattle+in+the+northeastern+United+States.">Associations of elevated nonesterified fatty acids and &#946;-hydroxybutyrate concentrations with early lactation reproductive performance and milk production in transition dairy cattle in the northeastern United States.</a> Journal of Dairy Science. 93 (4), 1596-1603 (2010).</li><li>Campos-Espinosa, A., Guzm&#225;n, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+experimental+steatosis+in+vitro:+hepatocyte+cell+culture+in+lipid+overload-conditioned+medium.">A model of experimental steatosis in vitro: hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e62543 (2021).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+nonesterified+fatty+acids+on+the+synthesis+and+assembly+of+very+low+density+lipoprotein+in+bovine+hepatocytes+in+vitro.">Effects of nonesterified fatty acids on the synthesis and assembly of very low density lipoprotein in bovine hepatocytes in vitro.</a> Journal of Dairy Science. 97 (3), 1328-1335 (2014).</li><li>Wang, L., Liu, J. Y., Miao, Z. J., Pan, Q. W., Cao, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+and+their+interactions+with+other+organelles+in+liver+diseases.">Lipid droplets and their interactions with other organelles in liver diseases.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 133, 105937 (2021).</li><li>Sanjabi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+hypertrophy:+a+crucial+determining+factor+in+insulin+regulation+by+adipocytes.">Lipid droplets hypertrophy: a crucial determining factor in insulin regulation by adipocytes.</a> Scientific Reports. 5, 8816 (2015).</li><li>Saponaro, C., Gaggini, M., Carli, F., Gastaldelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subtle+balance+between+lipolysis+and+lipogenesis:+a+critical+point+in+metabolic+homeostasis.">The subtle balance between lipolysis and lipogenesis: a critical point in metabolic homeostasis.</a> Nutrients. 7 (11), 9453-9474 (2015).</li><li>Yang, A., Mottillo, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+lipolysis:+from+molecular+mechanisms+of+regulation+to+disease+and+therapeutics.">Adipocyte lipolysis: from molecular mechanisms of regulation to disease and therapeutics.</a> Biochemical Journal. 477 (5), 985-1008 (2020).</li><li>Gluchowski, N. L., Becuwe, M., Walther, T. C., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+and+liver+disease:+from+basic+biology+to+clinical+implications.">Lipid droplets and liver disease: from basic biology to clinical implications.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 14 (6), 343-355 (2017).</li><li>Meex, R. C. R., Schrauwen, P., Hesselink, M. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+myocellular+fat+stores:+lipid+droplet+dynamics+in+health+and+disease.">Modulation of myocellular fat stores: lipid droplet dynamics in health and disease.</a> American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 913-924 (2009).</li><li>Sarnyai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cis-and+trans-monounsaturated+fatty+acids+on+palmitate+toxicity+and+on+palmitate-induced+accumulation+of+ceramides+and+diglycerides.">Effect of cis-and trans-monounsaturated fatty acids on palmitate toxicity and on palmitate-induced accumulation of ceramides and diglycerides.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2626 (2020).</li><li>Ricchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effect+of+oleic+and+palmitic+acid+on+lipid+accumulation+and+apoptosis+in+cultured+hepatocytes.">Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (5), 830-840 (2009).</li><li>Fei, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+phosphatidic+acid+in+the+formation+of+&amp;#34;supersized&amp;#34;+lipid+droplets.">A role for phosphatidic acid in the formation of &amp;#34;supersized&amp;#34; lipid droplets.</a> PLoS Genetics. 7 (7), e1002201 (2011).</li><li>Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BODIPY-based+probes+for+the+fluorescence+imaging+of+biomolecules+in+living+cells.">BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells.</a> Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+fluorescent+dye+BODIPY+in+the+study+of+lipid+dynamics+of+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae.">Application of the fluorescent dye BODIPY in the study of lipid dynamics of the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> Molecules. 23 (7), 1594 (2018).</li></ol>

בהתאם למצבים פתולוגיים, LDs בכבד עוברים שינויים עצומים בגודל ובמספר. LDs נמצאים באופן נרחב בתאי הפטוציטים וממלאים תפקיד מפתח בבריאות הכבד ובמחלות18. הכמות והגודל של LDs הם הבסיס למחקר הנוכחי על הביוגנזה של LDs19. הגודל והמספר של LDs עבור תאים ורקמות משקפים את יכולתם לאחסן ...

הצטברות טיפות שומנים (LD) בהפטוציטים היא המאפיין האופייני של מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD), אשר יכולה להתקדם לפיברוזיס בכבד וקרצינומה הפטוצלולרית. נמצא כי הביטוי המוקדם ביותר של מחלת כבד שומני הוא סטאטוזיס, המאופיין הצטברות LD בציטופלסמה של הפטוציטים1. סטאטוזיס בכבד קשורה תמיד למספר מוגבר ו / או גודל מורחב של LDs2. LDs נחשבים להיווצר מן הרשתית האנדופלסמית (ER), המורכבת טריגליצרידים (TG) כמו הליבה, והם מוקפים חלבונים ופוספוליפידים3. כאברונים תת-תאיים האחראים על אחסון TG, LDs מפגינים תכונות שונות לגבי גודלם, מספרם, הרכב השומנים, חלבונים ואינטראקציה עם אברונים אחרים, שכולם משפיעים על הומאוסטזיס אנרגיית התא4. רמת TG מתואמת באופן חיובי עם גודל LDs, ותכולת TG תוך-תאית גבוהה יותר יכולה ליצור LDs5 גדולים יותר. LDs גדלים באמצעות סינתזה מקומית של TG, שילוב שומנים בחדר המיון, ואיחוי של LDsמרובים 6. תאים (אדיפוציטים, הפטוציטים וכו ') המכילים LDs גדולים יש מנגנון מיוחד כדי להגדיל ביעילות את אחסון השומנים על ידי היתוך LD. השינויים הדינמיים של LDs משקפים את מצבי חילוף החומרים השונים של האנרגיה של התא. חיוני לפתח מתודולוגיות המאפשרות תצפית וניתוח של LDs שונים בכבד בתאים בריאים ולא תקינים.
הצבעים העיקריים שאינם פלואורסצנטיים עבור LDs הם סודן שחור B ואדום שמן O. סודן שחור B כתמים שומנים ניטרליים, פוספוליפידים וסטרואידים7. שמן אדום O משמש בעיקר להכתמת LDs של שרירי השלד, קרדיומיוציטים, רקמת כבד, תאי שומן וכו '8., ונחשב לכלי סטנדרטי לזיהוי כמותי של סטאטוזיס בכבד בעכברים ובבני אדם9. השינוי הדינמי של LDs מתבצע בעיקר על ידי צביעה פלואורסצנטית. אדום הנילוס ו BODIPY הם שניהם צבעי שומנים פלואורסצנטייםנפוצים 10,11. בהשוואה לאדום הנילוס, ל-BODIPY יש חדירות רקמות חזקה יותר והוא נקשר טוב יותר עם LDs12. LDs המסומנים BODIPY יכולים לשמש להכתמת תאים חיים וקולוקליזציה עם אברונים אחרים13.
שכיחות מחלת כבד שומני גבוהה משמעותית בבעלי חיים מעלי גירה מאשר בבעלי חיים חד-קיבתיים14. במהלך תקופת המעבר, פרות חולבות חוות מצב של מאזן אנרגיה שלילי3. כמויות גדולות של חומצות שומן לא אסטריות (חומצה פלמיטית, חומצה אולאית, חומצה לינולאית וכו ') מסונתזות ל- TGs בהפטוציטים של בקר, מה שמוביל להפרעות תפקודיות בכבד ומקטין מאוד את איכות מוצרי החלב ואת יעילות הייצור15. המחקר הנוכחי נועד לספק פרוטוקול לניתוח הגודל והמספר של LDs, כמו גם לפקח על דינמיקת היתוך LD. בנינו מודל של היווצרות LD על ידי הוספת ריכוזים שונים של חומצה לינולאית (LA) בהפטוציטים16 וצפינו בשינויים בגודל ובמספר LDs במהלך התהליך על ידי צביעת LDs עם שמן אדום O. בנוסף, תהליך האיחוי המהיר של LDs נצפה גם על ידי צביעה עם BODIPY 493/503.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1110</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY 493/503</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>2295015</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cedar oil</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>C7140</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell counting chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353002</td>
			<td>material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell sens software&#160;</td>
			<td>Olympus IX73</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2492319</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hematoxylin</td>
			<td>DingGuo</td>
			<td>AR0712</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image view</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>image analysis sodtware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>linoleic acid</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>SL8520</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Cell Station</td>
			<td>Nikon A1 HD25</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oil red O</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1260</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optical microscope</td>
			<td>Olympus IX73</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin &#38; Streptomycin 100&#215;</td>
			<td>NCM Biotech</td>
			<td>CLOOC5</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30258.01</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing agent</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S2150</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of lipid droplet size and fusion in bovine hepatic cells

טיפות שומנים (LDs) הן אברונים הממלאים תפקיד חשוב בחילוף חומרים של שומנים ובאחסון שומנים נייטרלי בתאים. הם קשורים למגוון מחלות מטבוליות, כגון השמנת יתר, מחלת כבד שומני וסוכרת. בתאי כבד, הגדלים והמספרים של LDs הם סימנים למחלת כבד שומני. יתר על כן, תגובת העקה החמצונית, אוטופגיה של תאים ואפופטוזיס מלווים לעתים קרובות בשינויים בגדלים ובמספרים של LDs. כתוצאה מכך, הממדים והכמות של LDs הם הבסיס למחקר הנוכחי לגבי המנגנון של ביוגנזה של LD. כאן, בתאי כבד בקר המושרים על ידי חומצות שומן, אנו מתארים כיצד להשתמש בשמן אדום O כדי להכתים LDs ולחקור את הגדלים והמספרים של LDs. התפלגות הגודל של LDs מנותחת סטטיסטית. התהליך של התמזגות LDs קטנים לתוך LDs גדולים נצפה גם על ידי מערכת הדמיה של תאים חיים. העבודה הנוכחית מספקת דרך לצפות ישירות במגמת שינוי הגודל של LDs בתנאים פיזיולוגיים שונים.

Lipid droplet (LD) accumulation in hepatocytes is the typical characteristic of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), which can progress to liver fibrosis and hepatocellular carcinoma. It has been found that the earliest manifestation of fatty liver disease is steatosis, characterized by LD accumulation in the cytoplasm of the hepatocyte1. Liver steatosis is invariably associated with an increased number and/or expanded size of LDs2. LDs are thought to be generated from the endoplasmic reticulum (ER), consisting of triglyceride (TG) as the core, and are surrounded by proteins and phospholipids3. As the subcellular organelle responsible for TG storage, LDs exhibit different features regarding their size, number, lipid composition, proteins, and interaction with other organelles, all of which affect cell energy homeostasis4. The TG level is positively correlated with the size of LDs, and a higher intracellular TG content could form larger LDs5. LDs increase in size through the local synthesis of TG, lipid incorporation in the ER, and the fusion of multiple LDs6. Cells (adipocytes, hepatocytes, etc.) that contain large LDs have a special mechanism to efficiently increase lipid storage by LD fusion. The dynamic changes of LDs reflect the different energy metabolism states of the cell. It is crucial to develop methodologies that allow the observation and analysis of the various hepatic LDs in healthy and abnormal cells.
The main non-fluorescent dyes for LDs are Sudan Black B and oil red O. Sudan Black B stains neutral lipids, phospholipids, and steroids7. Oil red O is mainly used for staining LDs of skeletal muscle, cardiomyocytes, liver tissue, adipose cells, etc8., and is considered a standard tool for the quantitative detection of liver steatosis in mice and humans9. The dynamic change of LDs is mainly carried out by fluorescence dyeing. Nile red and BODIPY are both commonly used fluorescent lipid dyes10,11. Compared with Nile red, BODIPY has stronger tissue permeability and binds better with LDs12. BODIPY-labeled LDs can be used for staining living cells and colocalization with other organelles13.
The incidence of fatty liver disease is significantly higher in ruminant animals than in monogastric animals14. During the transition period, dairy cows experience a state of negative energy balance3. Large quantities of non-esterified fatty acids (palmitic acid, oleic acid, linoleic acid, etc.) are synthesized into TGs in bovine hepatocytes, which leads to liver functional abnormality and greatly reduces the quality of milk products and production efficiency15. The present study aims to provide a protocol to analyze the size and the number of LDs, as well as to monitor the LD fusion dynamics. We constructed a model of LD formation by adding different concentrations of linoleic acid (LA) in hepatocytes16 and observed the changes in the size and the number of LDs during the process by staining LDs with oil red O. In addition, the process of the rapid fusion of LDs was also observed by staining with BODIPY 493/503.

זרקור המחבר: הערכת גודל טיפות שומנים ואיחוי בתאי כבד בקר  

הערכת גודל טיפות שומנים ואיחוי בתאי כבד בקר

Our research focus on the lipid droplet number and the size induced by linoleic acid in liver cells. Additionally, we aim to provide insights into the mechanism of the fatty liver. Recent advancements in this field of research, suggests that choline, CCT alpha, established induced autophagy, can regulate lipid droplet size in bovine hepatic cells.Moreover, living cell workstation observations have shown that phospholipids have a considerable effect on lipid droplet fusion. Currently, gene aiding, fluorescence tweezer, liquid chromatography, omics analysis, single chromatography, flow cytometry, and other technologies are being used to group the vast research in this field. The experimental method has some limitations.For example, the phenomenon of limited fields can only be observed for lipid droplet fields and under a certain flight of waste. Oil Red O staining is more convenient, less expensive, and more widely used to measure the apparent size of lipid droplets than lipid droplet fluorescence staining. It is simple to operate and requires less equipment.Furthermore, we directly observe this phenomenal of lipid fusion through the living cell station. This study provide a simple and repeatable method to observe lipid droplet size and fusion, which can be widely applied to lipid droplet analysis in cellular lipid metabolism research. We will continue to conduct intensive research on lipid droplets, focusing on the mechanism of lipid droplet fusion and the structure changes of fatty liver in dairy cows.

הצביעה של תאי LDs מוצגת באיור 1. הנקודות האדומות משקפות LDs של תאים, והנקודות הכחולות משקפות את הגרעינים. ניתן לראות כי הגודל והמספר של LDs בכל תמונה שונים תחת הטיפול של לוס אנג'לס.
עם העלייה במינון LA, הקוטר הממוצע והמספר של LDs הראו מגמת עלייה משמעותית, בהתאם לריכוז ...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Lipid Droplet Size and Fusion in Bovine Hepatic Cells at JoVE.com

הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד להשתמש בשמן אדום O כדי לצבוע טיפות שומנים (LDs), לחשב את הגודל והמספר של LDs במודל הפטוציטים שומניים המושרה על ידי חומצות שומן, ולהשתמש ב- BODIPY 493/503 כדי לצפות בתהליך של LDs קטנים המתמזגים ל- LDs גדולים על ידי הדמיה של תאים חיים.

Lipid droplets (LDs) are organelles that play an important role in lipid metabolism and neutral lipid storage in cells. They are associated with a variety ...

המחקר שלנו מתמקד במספר טיפות השומנים ובגודל המושרה על ידי חומצה לינולאית בתאי כבד. בנוסף, אנו שואפים לספק תובנות לגבי המנגנון של הכבד השומני. ההתקדמות האחרונה בתחום מחקר זה, מצביעה על כך שכולין, CCT אלפא, אוטופגיה מושרית מבוססת, יכול לווסת את גודל טיפות השומנים בתאי כבד בקר.יתר על כן, תצפיות בתחנות עבודה של תאים חיים הראו כי לפוספוליפידים יש השפעה ניכרת על איחוי טיפות שומנים. כיום, נעשה שימוש בסיוע גנטי, טוויטר פלואורסצנטי, כרומטוגרפיה נוזלית, ניתוח אומיקס, כרומטוגרפיה יחידה, ציטומטריית זרימה וטכנולוגיות אחרות כדי לקבץ את המחקר העצום בתחום זה. לשיטה הניסיונית יש כמה מגבלות.לדוגמה, את התופעה של שדות מוגבלים ניתן לראות רק עבור שדות טיפות שומנים תחת טיסה מסוימת של פסולת. צביעת שמן אדום O נוחה יותר, זולה יותר ונמצאת בשימוש נרחב יותר למדידת הגודל הנראה לעין של טיפות שומנים מאשר צביעה פלואורסצנטית של טיפות שומנים. זה פשוט לתפעול ודורש פחות ציוד.יתר על כן, אנו צופים ישירות בתופעה זו של איחוי שומנים דרך תחנת התא החי. מחקר זה מספק שיטה פשוטה וחוזרת על עצמה לצפייה בגודל טיפות השומנים ובאיחוי, אשר ניתן ליישם באופן נרחב בניתוח טיפות שומנים במחקר מטבוליזם של שומנים בתאים. נמשיך לערוך מחקר אינטנסיבי על טיפות שומנים, תוך התמקדות במנגנון איחוי טיפות השומנים ושינויי המבנה של כבד שומני בפרות חולבות.

הערכת גודל טיפות שומנים ואיחוי בתאי כבד בקר

Abstract