이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (U1904116)이 공동으로 지원했습니다.

모든 절차는 허난농업대학교(중국 허난성) 동물관리위원회의 윤리적 기준에 따라 승인되고 수행되었습니다.
1. 소 간세포 배양
<ol><li>1차 간세포17 을 해동하고 실온에서 4분 동안 400 x g 의 원심분리를 실시한다. 참고: 일차 간세포 세포는 이전에 발표된 보고서17에 따라 배양 및 유지되었다.</li>
	<li>냉동 보관 용액을 ?...

Oil Red O 및 BODIPY를 사용한 지질 방울 크기 및 융합의 라이브 셀 이미징

<ol>
	<li>Fujimoto, T., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Not+just+fat:+the+structure+and+function+of+the+lipid+droplet.">Not just fat: the structure and function of the lipid droplet.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), 004838 (2011).</li><li>Grasselli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+non-alcoholic+fatty+liver+disease+and+potential+translational+value:+The+effects+of+3,5-L-diiodothyronine.">Models of non-alcoholic fatty liver disease and potential translational value: The effects of 3,5-L-diiodothyronine.</a> Annals of Hepatology. 16 (5), 707-719 (2017).</li><li>Herdt, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ruminant+adaptation+to+negative+energy+balance:+Influences+on+the+etiology+of+ketosis+and+fatty+liver.">Ruminant adaptation to negative energy balance: Influences on the etiology of ketosis and fatty liver.</a> Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 16 (2), 215-230 (2000).</li><li>Pino-de la Fuente, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+regulation+of+hepatic+lipid+droplet+metabolism.">Exercise regulation of hepatic lipid droplet metabolism.</a> Life Sciences. 298, 120522 (2022).</li><li>O'Connor, D., Byrne, A., Berselli, G. B., Long, C., Keyes, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mega-stokes+pyrene+ceramide+conjugates+for+STED+imaging+of+lipid+droplets+in+live+cells.">Mega-stokes pyrene ceramide conjugates for STED imaging of lipid droplets in live cells.</a> Analyst. 144 (5), 1608-1621 (2019).</li><li>Gao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+lipid+droplet+fusion+and+growth+by+CIDE+family+proteins.">Control of lipid droplet fusion and growth by CIDE family proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1197-1204 (2017).</li><li>T&#252;t&#252;nc&#252; Konyar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+insoluble+polysaccharides+and+neutral+lipids+in+the+developing+anthers+of+an+endangered+plant+species,+Pancratium+maritimum.">Dynamic changes in insoluble polysaccharides and neutral lipids in the developing anthers of an endangered plant species, Pancratium maritimum.</a> Plant Systematics and Evolution. 304, 397-414 (2018).</li><li>Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+BODIPY+(493/503)+to+visualize+intramuscular+lipid+droplets+in+skeletal+muscle.">Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 598358 (2011).</li><li>Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+neutral+lipids+by+oil+red+O+for+analyzing+the+metabolic+status+in+health+and+disease.">Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1149-1154 (2013).</li><li>Diaz, G., Melis, M., Batetta, B., Angius, F., Falchi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrophobic+characterization+of+intracellular+lipids+in+situ+by+Nile+Red+red/yellow+emission+ratio.">Hydrophobic characterization of intracellular lipids in situ by Nile Red red/yellow emission ratio.</a> Micron. 39 (7), 819-824 (2008).</li><li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synthesis+of+polarity-sensitive+fluorescent+dyes+based+on+the+BODIPY+chromophore.">The synthesis of polarity-sensitive fluorescent dyes based on the BODIPY chromophore.</a> Dyes and Pigments. 89 (3), 217-222 (2011).</li><li>Rumin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescent+Nile+red+and+BODIPY+for+lipid+measurement+in+microalgae.">The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae.</a> Biotechnology for Biofuels. 8, 42 (2015).</li><li>Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+fluorescent+probes+for+lipid+droplets.">Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets.</a> Materials. 11 (9), 1768 (2018).</li><li>Raboisson, D., Mouni&#233;, M., Maign&#233;, &. #. 2. 0. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diseases,+reproductive+performance,+and+changes+in+milk+production+associated+with+subclinical+ketosis+in+dairy+cows:+A+meta-analysis+and+review.">Diseases, reproductive performance, and changes in milk production associated with subclinical ketosis in dairy cows: A meta-analysis and review.</a> Journal of Dairy Science. 97 (12), 7547-7563 (2014).</li><li>Ospina, P. A., Nydam, D. V., Stokol, T., Overton, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+of+elevated+nonesterified+fatty+acids+and+&#946;-hydroxybutyrate+concentrations+with+early+lactation+reproductive+performance+and+milk+production+in+transition+dairy+cattle+in+the+northeastern+United+States.">Associations of elevated nonesterified fatty acids and &#946;-hydroxybutyrate concentrations with early lactation reproductive performance and milk production in transition dairy cattle in the northeastern United States.</a> Journal of Dairy Science. 93 (4), 1596-1603 (2010).</li><li>Campos-Espinosa, A., Guzm&#225;n, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+experimental+steatosis+in+vitro:+hepatocyte+cell+culture+in+lipid+overload-conditioned+medium.">A model of experimental steatosis in vitro: hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e62543 (2021).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+nonesterified+fatty+acids+on+the+synthesis+and+assembly+of+very+low+density+lipoprotein+in+bovine+hepatocytes+in+vitro.">Effects of nonesterified fatty acids on the synthesis and assembly of very low density lipoprotein in bovine hepatocytes in vitro.</a> Journal of Dairy Science. 97 (3), 1328-1335 (2014).</li><li>Wang, L., Liu, J. Y., Miao, Z. J., Pan, Q. W., Cao, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+and+their+interactions+with+other+organelles+in+liver+diseases.">Lipid droplets and their interactions with other organelles in liver diseases.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 133, 105937 (2021).</li><li>Sanjabi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+hypertrophy:+a+crucial+determining+factor+in+insulin+regulation+by+adipocytes.">Lipid droplets hypertrophy: a crucial determining factor in insulin regulation by adipocytes.</a> Scientific Reports. 5, 8816 (2015).</li><li>Saponaro, C., Gaggini, M., Carli, F., Gastaldelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subtle+balance+between+lipolysis+and+lipogenesis:+a+critical+point+in+metabolic+homeostasis.">The subtle balance between lipolysis and lipogenesis: a critical point in metabolic homeostasis.</a> Nutrients. 7 (11), 9453-9474 (2015).</li><li>Yang, A., Mottillo, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+lipolysis:+from+molecular+mechanisms+of+regulation+to+disease+and+therapeutics.">Adipocyte lipolysis: from molecular mechanisms of regulation to disease and therapeutics.</a> Biochemical Journal. 477 (5), 985-1008 (2020).</li><li>Gluchowski, N. L., Becuwe, M., Walther, T. C., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+and+liver+disease:+from+basic+biology+to+clinical+implications.">Lipid droplets and liver disease: from basic biology to clinical implications.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 14 (6), 343-355 (2017).</li><li>Meex, R. C. R., Schrauwen, P., Hesselink, M. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+myocellular+fat+stores:+lipid+droplet+dynamics+in+health+and+disease.">Modulation of myocellular fat stores: lipid droplet dynamics in health and disease.</a> American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 913-924 (2009).</li><li>Sarnyai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cis-and+trans-monounsaturated+fatty+acids+on+palmitate+toxicity+and+on+palmitate-induced+accumulation+of+ceramides+and+diglycerides.">Effect of cis-and trans-monounsaturated fatty acids on palmitate toxicity and on palmitate-induced accumulation of ceramides and diglycerides.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2626 (2020).</li><li>Ricchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effect+of+oleic+and+palmitic+acid+on+lipid+accumulation+and+apoptosis+in+cultured+hepatocytes.">Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (5), 830-840 (2009).</li><li>Fei, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+phosphatidic+acid+in+the+formation+of+&amp;#34;supersized&amp;#34;+lipid+droplets.">A role for phosphatidic acid in the formation of &amp;#34;supersized&amp;#34; lipid droplets.</a> PLoS Genetics. 7 (7), e1002201 (2011).</li><li>Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BODIPY-based+probes+for+the+fluorescence+imaging+of+biomolecules+in+living+cells.">BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells.</a> Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+fluorescent+dye+BODIPY+in+the+study+of+lipid+dynamics+of+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae.">Application of the fluorescent dye BODIPY in the study of lipid dynamics of the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> Molecules. 23 (7), 1594 (2018).</li></ol>

병리학 적 상태에 따라 간 LD는 크기와 수에 엄청난 변화를 겪습니다. LD는 간세포 세포에 널리 존재하며 간 건강과 질병에 중요한 역할을 한다18. LD의 양과 크기는 LD의 생물 발생에 대한 현재 연구의 기초입니다19. 세포와 조직의 LD의 크기와 수는 에너지를 저장하고 방출하는 능력을 반영합니다. LD의 동적 변화는 지질 대사 활동의 안정성을 유지합니다<sup class="x...

간세포에 지질 액적(LD) 축적은 간 섬유증 및 간세포 암종으로 진행될 수 있는 비알코올성 지방간 질환(NAFLD)의 전형적인 특징입니다. 지방간 질환의 가장 초기 증상은 간세포1의 세포질에 LD가 축적되는 것을 특징으로하는 지방증이라는 것이 밝혀졌습니다. 간 지방증은 항상 LD의 수 증가 및/또는 크기 증가와 관련이 있다2. LD는 중성지방(TG)을 핵심으로 하는 소포체(ER)에서 생성되는 것으로 생각되며, 단백질과 인지질로 둘러싸여 있다3. LD는 TG 저장을 담당하는 세포내 소기관으로서 크기, 수, 지질 조성, 단백질 및 다른 소기관과의 상호 작용과 관련하여 다양한 특징을 나타내며, 이 모든 것이 세포 에너지 항상성에 영향을 미칩니다4. TG 수준은 LD의 크기와 양의 상관관계가 있으며, 세포 내 TG 함량이 높을수록 더 큰 LD를 형성할 수 있다5. LD는 TG의 국소 합성, ER에서의 지질 혼입 및 다중 LD의 융합을 통해 크기가 증가한다6. 큰 LD를 포함하는 세포(지방세포, 간세포 등)는 LD 융합에 의해 효율적으로 지질 저장을 증가시키는 특별한 메커니즘을 가지고 있습니다. LD의 동적 변화는 세포의 다양한 에너지 대사 상태를 반영합니다. 건강한 세포와 비정상 세포에서 다양한 간 LD를 관찰하고 분석할 수 있는 방법론을 개발하는 것이 중요합니다.
LD의 주요 비형광 염료는 수단 블랙 B와 오일 레드 O입니다. 수단 블랙 B는 중성 지질, 인지질 및 스테로이드를 염색합니다7. 오일 레드 O는 주로 골격근, 심근 세포, 간 조직, 지방 세포 등의 LD를 염색하는 데 사용됩니다8., 생쥐와 인간의 간 지방증을 정량적으로 검출하기위한 표준 도구로 간주됩니다9. LD의 동적 변화는 주로 형광 염색에 의해 수행됩니다. 나일 레드와 BODIPY는 모두 일반적으로 사용되는 형광 지질 염료10,11입니다. 나일 레드와 비교하여 BODIPY는 조직 투과성이 더 강하고 LD와 더 잘 결합합니다12. BODIPY로 표지된 LD는 살아있는 세포를 염색하고 다른 세포 기관과 공동국소화하는 데 사용할 수 있다13.
지방간 질환의 발병률은 반추 동물에서 단위 동물보다 유의하게 높다14. 전환 기간 동안 젖소는 부정적인 에너지 균형 상태를 경험합니다3. 다량의 비에스테르화 지방산(팔미트산, 올레산, 리놀레산 등)이 소 간세포에서 TG로 합성되어 간 기능 이상을 유발하고 유제품의 품질과 생산 효율성을 크게 저하시킨다15. 본 연구는 LD의 크기와 수를 분석하고 LD 융합 역학을 모니터링하는 프로토콜을 제공하는 것을 목표로 합니다. 우리는 간세포(16 )에 서로 다른 농도의 리놀레산(LA)을 첨가하여 LD 형성 모델을 구성하고, LD를 오일 레드 O로 염색하여 공정 중 LD의 크기와 수의 변화를 관찰했습니다. 또한, LD의 빠른 융합 과정은 BODIPY 493/503으로 염색하여 관찰되었습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1110</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY 493/503</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>2295015</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cedar oil</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>C7140</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell counting chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353002</td>
			<td>material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell sens software&#160;</td>
			<td>Olympus IX73</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2492319</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hematoxylin</td>
			<td>DingGuo</td>
			<td>AR0712</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image view</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>image analysis sodtware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>linoleic acid</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>SL8520</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live Cell Station</td>
			<td>Nikon A1 HD25</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oil red O</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1260</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optical microscope</td>
			<td>Olympus IX73</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin &#38; Streptomycin 100&#215;</td>
			<td>NCM Biotech</td>
			<td>CLOOC5</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30258.01</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing agent</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>S2150</td>
			<td>reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of lipid droplet size and fusion in bovine hepatic cells

지질 방울(LD)은 세포의 지질 대사와 중성 지질 저장에 중요한 역할을 하는 세포 소기관입니다. 그들은 비만, 지방간 질환 및 당뇨병과 같은 다양한 대사 질환과 관련이 있습니다. 간세포에서 LD의 크기와 수는 지방간 질환의 징후입니다. 또한, 산화 스트레스 반응, 세포 자가포식 및 세포자멸사는 종종 LD의 크기와 수의 변화를 동반합니다. 결과적으로, LD의 크기와 양은 LD 생물 발생의 메커니즘에 관한 현재 연구의 기초입니다. 여기에서는 지방산 유발 소 간 세포에서 오일 레드 O를 사용하여 LD를 염색하고 LD의 크기와 수를 조사하는 방법을 설명합니다. LD의 크기 분포는 통계적으로 분석됩니다. 작은 LD가 큰 LD로 융합되는 과정은 라이브 셀 이미징 시스템에서도 관찰됩니다. 현재의 연구는 다양한 생리적 조건에서 LD의 크기 변화 추세를 직접 관찰할 수 있는 방법을 제공합니다.

Lipid droplet (LD) accumulation in hepatocytes is the typical characteristic of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), which can progress to liver fibrosis and hepatocellular carcinoma. It has been found that the earliest manifestation of fatty liver disease is steatosis, characterized by LD accumulation in the cytoplasm of the hepatocyte1. Liver steatosis is invariably associated with an increased number and/or expanded size of LDs2. LDs are thought to be generated from the endoplasmic reticulum (ER), consisting of triglyceride (TG) as the core, and are surrounded by proteins and phospholipids3. As the subcellular organelle responsible for TG storage, LDs exhibit different features regarding their size, number, lipid composition, proteins, and interaction with other organelles, all of which affect cell energy homeostasis4. The TG level is positively correlated with the size of LDs, and a higher intracellular TG content could form larger LDs5. LDs increase in size through the local synthesis of TG, lipid incorporation in the ER, and the fusion of multiple LDs6. Cells (adipocytes, hepatocytes, etc.) that contain large LDs have a special mechanism to efficiently increase lipid storage by LD fusion. The dynamic changes of LDs reflect the different energy metabolism states of the cell. It is crucial to develop methodologies that allow the observation and analysis of the various hepatic LDs in healthy and abnormal cells.
The main non-fluorescent dyes for LDs are Sudan Black B and oil red O. Sudan Black B stains neutral lipids, phospholipids, and steroids7. Oil red O is mainly used for staining LDs of skeletal muscle, cardiomyocytes, liver tissue, adipose cells, etc8., and is considered a standard tool for the quantitative detection of liver steatosis in mice and humans9. The dynamic change of LDs is mainly carried out by fluorescence dyeing. Nile red and BODIPY are both commonly used fluorescent lipid dyes10,11. Compared with Nile red, BODIPY has stronger tissue permeability and binds better with LDs12. BODIPY-labeled LDs can be used for staining living cells and colocalization with other organelles13.
The incidence of fatty liver disease is significantly higher in ruminant animals than in monogastric animals14. During the transition period, dairy cows experience a state of negative energy balance3. Large quantities of non-esterified fatty acids (palmitic acid, oleic acid, linoleic acid, etc.) are synthesized into TGs in bovine hepatocytes, which leads to liver functional abnormality and greatly reduces the quality of milk products and production efficiency15. The present study aims to provide a protocol to analyze the size and the number of LDs, as well as to monitor the LD fusion dynamics. We constructed a model of LD formation by adding different concentrations of linoleic acid (LA) in hepatocytes16 and observed the changes in the size and the number of LDs during the process by staining LDs with oil red O. In addition, the process of the rapid fusion of LDs was also observed by staining with BODIPY 493/503.

저자 스포트라이트: 소 간세포의 지질 액적 크기 및 융합 평가  

소 간세포에서 지질 액적 크기 및 융합 평가

Our research focus on the lipid droplet number and the size induced by linoleic acid in liver cells. Additionally, we aim to provide insights into the mechanism of the fatty liver. Recent advancements in this field of research, suggests that choline, CCT alpha, established induced autophagy, can regulate lipid droplet size in bovine hepatic cells.Moreover, living cell workstation observations have shown that phospholipids have a considerable effect on lipid droplet fusion. Currently, gene aiding, fluorescence tweezer, liquid chromatography, omics analysis, single chromatography, flow cytometry, and other technologies are being used to group the vast research in this field. The experimental method has some limitations.For example, the phenomenon of limited fields can only be observed for lipid droplet fields and under a certain flight of waste. Oil Red O staining is more convenient, less expensive, and more widely used to measure the apparent size of lipid droplets than lipid droplet fluorescence staining. It is simple to operate and requires less equipment.Furthermore, we directly observe this phenomenal of lipid fusion through the living cell station. This study provide a simple and repeatable method to observe lipid droplet size and fusion, which can be widely applied to lipid droplet analysis in cellular lipid metabolism research. We will continue to conduct intensive research on lipid droplets, focusing on the mechanism of lipid droplet fusion and the structure changes of fatty liver in dairy cows.

세포 LD의 염색은 도 1에 나타내었다. 빨간색 점은 세포 LD를 나타내고 파란색 점은 핵을 나타냅니다. 각 사진의 LD의 크기와 수는 LA의 처리에 따라 다르다는 것을 알 수 있습니다.
LA 투여량의 증가에 따라, LD의 평균 직경 및 수는 LA 농도에 따라 유의하게 증가하는 경향을 보였다(도 2). 도 2A에 나타낸 바와 같이,...

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본 프로토콜은 오일 레드 O를 사용하여 지질 방울(LD)을 염색하고, 지방산 유도 지방 간세포 모델에서 LD의 크기와 수를 계산하고, BODIPY 493/503을 사용하여 작은 LD가 큰 LD로 융합되는 과정을 관찰하는 방법을 설명합니다.

Lipid droplets (LDs) are organelles that play an important role in lipid metabolism and neutral lipid storage in cells. They are associated with a variety ...

우리의 연구는 간세포에서 리놀레산에 의해 유도 된 지질 방울 수와 크기에 중점을 둡니다. 또한, 우리는 지방간의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하는 것을 목표로합니다. 이 연구 분야의 최근 발전은 유도된 자가포식을 확립한 콜린, CCT 알파가 소 간 세포에서 지질 액적 크기를 조절할 수 있음을 시사합니다.또한, 살아있는 세포 워크스테이션 관찰은 인지질이 지질 방울 융합에 상당한 영향을 미친다는 것을 보여주었습니다. 현재 유전자 보조, 형광 핀셋, 액체 크로마토그래피, 오믹스 분석, 단일 크로마토그래피, 유세포 분석 및 기타 기술이 이 분야의 방대한 연구를 그룹화하는 데 사용되고 있습니다. 실험 방법에는 몇 가지 한계가 있습니다.예를 들어, 제한된 필드의 현상은 지질 방울 필드와 특정 폐기물 비행 하에서만 관찰 할 수 있습니다. Oil Red O 염색은 지질 액적 형광 염색보다 지질 액적의 겉보기 크기를 측정하는 데 더 편리하고 저렴하며 널리 사용됩니다. 작동이 간단하고 장비가 덜 필요합니다.또한, 우리는 살아있는 세포 스테이션을 통해 이 경이로운 지질 융합을 직접 관찰합니다. 본 연구는 세포 지질 대사 연구에서 지질 액적 분석에 널리 적용될 수 있는 지질 액적 크기 및 융합을 관찰하는 간단하고 반복 가능한 방법을 제공합니다. 우리는 지질 방울 융합 메커니즘과 젖소의 지방간 구조 변화에 초점을 맞춰 지질 방울에 대한 집중적인 연구를 계속 수행할 것입니다.

소 간세포에서 지질 액적 크기 및 융합 평가

Abstract