Avaliação do Tamanho e Fusão de Gotículas Lipídicas em Células Hepáticas Bovinas

Summary

O presente protocolo descreve como usar óleo vermelho O para tingir gotículas lipídicas (DLs), calcular o tamanho e o número de DLs em um modelo de hepatócitos gordurosos induzidos por ácidos graxos e usar BODIPY 493/503 para observar o processo de fusão de pequenas LDs em grandes LDs por imagem de células vivas.

Abstract

As gotículas lipídicas (DLs) são organelas que desempenham um papel importante no metabolismo lipídico e no armazenamento neutro de lipídios nas células. Eles estão associados a uma variedade de doenças metabólicas, como obesidade, doença hepática gordurosa e diabetes. Nas células hepáticas, os tamanhos e o número de DLs são sinais de doença hepática gordurosa. Além disso, a reação de estresse oxidativo, a autofagia celular e a apoptose são frequentemente acompanhadas por mudanças nos tamanhos e números de DLs. Como resultado, as dimensões e a quantidade de DLs são a base da pesquisa atual sobre o mecanismo de biogênese da DL. Aqui, em células hepáticas bovinas induzidas por ácidos graxos, descrevemos como usar o óleo vermelho O para corar LDs e investigar os tamanhos e números de LDs. A distribuição de tamanho dos GDs é analisada estatisticamente. O processo de fusão de pequenos LDs em grandes LDs também é observado por um sistema de imagem de células vivas. O presente trabalho fornece uma maneira de observar diretamente a tendência de mudança de tamanho dos DLs sob diferentes condições fisiológicas.

Introduction

O acúmulo de gotículas lipídicas (DL) nos hepatócitos é a característica típica da doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA), que pode evoluir para fibrose hepática e carcinoma hepatocelular. Verificou-se que a manifestação mais precoce da doença hepática gordurosa é a esteatose, caracterizada pelo acúmulo de DL no citoplasma do hepatócito1. A esteatose hepática está invariavelmente associada ao aumento do número e/ou expansão do tamanho dos^DLs2. Acredita-se que os LDs sejam gerados a partir do retículo endoplasmático (RE), consistindo de triglicerídeos (TG) como núcleo, e são circundados por proteínas e fosfolipíd....

Protocol

Todos os procedimentos foram aprovados e realizados de acordo com os padrões éticos do Comitê de Cuidados com Animais da Universidade Agrícola de Henan (Província de Henan, China).

1. Cultura de células de hepatócitos bovinos

1. Descongelar as células primárias do hepatócito¹⁷ e centrifugar 400 x g por 4 min à temperatura ambiente.
   NOTA: As células primárias dos hepatócitos foram cultivadas e mantidas seguindo um relato .......

Discussion

Dependendo dos estados patológicos, os LDs hepáticos sofrem tremendas mudanças em seu tamanho e número. Os DLs estão amplamente presentes nas células dos hepatócitos e desempenham um papel fundamental na saúde e doença^hepática18. A quantidade e o tamanho dos DLs são a base da pesquisa atual sobre a biogênese dos DLs¹⁹. O tamanho e o número de LDs para células e tecidos refletem sua capacidade de armazenar e liberar energia. As alterações dinâmicas dos GDs m.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin	Gibco	25200072	reagent
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110	reagent
BODIPY 493/503	invitrogen	2295015	reagent
Cedar oil	Solarbio	C7140	reagent
cell counting chamber			equipment
cell culture dish	Corning	353002	material
cell sens software	Olympus IX73		software
Centrifuge	Eppendorf		equipment
DMEM	HyClone	SH30022.01	reagent
Fetal Bovine Serum	Gibco	2492319	reagent
hematoxylin	DingGuo	AR0712	reagent
Image view			image analysis sodtware
linoleic acid	Solarbio	SL8520	reagent
Live Cell Station	Nikon A1 HD25		equipment
NIS-Elements	Nikon		software
oil red O	Solarbio	G1260	reagent
optical microscope	Olympus IX73		equipment
Penicillin & Streptomycin 100×	NCM Biotech	CLOOC5	reagent
Phosphate Buffered Saline	HyClone	SH30258.01	reagent
Pipette	Eppendorf		equipment
Sealing agent	Solarbio	S2150	reagent