High-throughput image-based kwantificering van mitochondriale DNA-synthese en -distributie

De overgrote meerderheid van cellulaire processen vereist een continue toevoer van energie, waarvan de meest voorkomende drager het ATP-molecuul is. Eukaryote cellen produceren het grootste deel van hun ATP in de mitochondriën door oxidatieve fosforylering. Mitochondriën zijn unieke organellen omdat ze hun eigen genoom hebben dat wordt gerepliceerd en doorgegeven aan de volgende generatie cellen. In tegenstelling tot het nucleaire genoom zijn er meerdere kopieën van het mitochondriale genoom in de cel. De gedetailleerde studie van de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de replicatie, reparatie en onderhoud van het mitochondriale genoom is essentieel voor het begrijpen van de goede werking van mitochondriën en hele cellen onder zowel normale als ziekteomstandigheden. Hier wordt een methode gepresenteerd die de high-throughput kwantificering van de synthese en distributie van mitochondriaal DNA (mtDNA) in menselijke cellen die in vitro zijn gekweekt, mogelijk maakt. Deze aanpak is gebaseerd op de immunofluorescentiedetectie van actief gesynthetiseerde DNA-moleculen gelabeld door 5-broom-2'-deoxyuridine (BrdU) -opname en de gelijktijdige detectie van alle mtDNA-moleculen met anti-DNA-antilichamen. Bovendien worden de mitochondriën gevisualiseerd met specifieke kleurstoffen of antilichamen. Het kweken van cellen in een multi-well formaat en het gebruik van een geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop maken het gemakkelijker om de dynamiek van mtDNA en de morfologie van mitochondriën onder verschillende experimentele omstandigheden in een relatief korte tijd te bestuderen.