Bildbasierte Hochdurchsatz-Quantifizierung der mitochondrialen DNA-Synthese und -Verteilung

Die überwiegende Mehrheit der zellulären Prozesse erfordert eine kontinuierliche Energiezufuhr, deren häufigster Träger das ATP-Molekül ist. Eukaryotische Zellen produzieren den größten Teil ihres ATP in den Mitochondrien durch oxidative Phosphorylierung. Mitochondrien sind einzigartige Organellen, weil sie ein eigenes Genom haben, das repliziert und an die nächste Generation von Zellen weitergegeben wird. Im Gegensatz zum Kerngenom gibt es in der Zelle mehrere Kopien des mitochondrialen Genoms. Die detaillierte Untersuchung der Mechanismen, die für die Replikation, Reparatur und Aufrechterhaltung des mitochondrialen Genoms verantwortlich sind, ist unerlässlich, um das ordnungsgemäße Funktionieren von Mitochondrien und ganzen Zellen sowohl unter normalen als auch unter Krankheitsbedingungen zu verstehen. Hier wird eine Methode vorgestellt, die die Hochdurchsatzquantifizierung der Synthese und Verteilung von mitochondrialer DNA (mtDNA) in in vitro kultivierten humanen Zellen ermöglicht. Dieser Ansatz basiert auf der Immunfluoreszenzdetektion von aktiv synthetisierten DNA-Molekülen, die durch den Einbau von 5-Brom-2'-Desoxyuridin (BrdU) markiert sind, und der gleichzeitigen Detektion aller mtDNA-Moleküle mit Anti-DNA-Antikörpern. Zusätzlich werden die Mitochondrien mit spezifischen Farbstoffen oder Antikörpern sichtbar gemacht. Die Kultivierung von Zellen im Multi-Well-Format und der Einsatz eines automatisierten Fluoreszenzmikroskops erleichtern es, die Dynamik der mtDNA und die Morphologie der Mitochondrien unter verschiedenen experimentellen Bedingungen in relativ kurzer Zeit zu untersuchen.