A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
כימות מבוסס תמונה בתפוקה גבוהה של סינתזה והפצה של DNA מיטוכונדריאלי
In This Article
Summary
מתואר הליך לחקר הדינמיקה של מטבוליזם של דנ"א מיטוכונדריאלי (mtDNA) בתאים באמצעות פורמט צלחת מרובת בארות והדמיה אימונופלואורסצנטית אוטומטית כדי לזהות ולכמת סינתזה והפצה של mtDNA. זה יכול לשמש גם כדי לחקור את ההשפעות של מעכבים שונים, לחצים תאיים והשתקת גנים על חילוף החומרים mtDNA.
Abstract
הרוב המכריע של תהליכים תאיים דורשים אספקה רציפה של אנרגיה, המוביל הנפוץ ביותר של אשר הוא מולקולת ATP. תאים אאוקריוטים מייצרים את רוב ה-ATP שלהם במיטוכונדריה על ידי זרחן חמצוני. מיטוכונדריה הם אברונים ייחודיים מכיוון שיש להם גנום משלהם המשוכפל ומועבר לדור הבא של התאים. בניגוד לגנום הגרעיני, ישנם עותקים רבים של הגנום המיטוכונדריאלי בתא. המחקר המפורט של המנגנונים האחראים לשכפול, תיקון ותחזוקה של הגנום המיטוכונדריאלי חיוני להבנת תפקודם התקין של מיטוכונדריה ותאים שלמים בתנאי נורמליות ומחלות כאחד. כאן מוצגת שיטה המאפשרת כימות בתפוקה גבוהה של סינתזה והפצה של DNA מיטוכונדריאלי (mtDNA) בתאים אנושיים בתרבית חוץ גופית . גישה זו מבוססת על זיהוי אימונופלואורסצנטי של מולקולות DNA מסונתזות באופן פעיל המסומנות על ידי שילוב 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) וזיהוי בו זמנית של כל מולקולות mtDNA עם נוגדנים נגד DNA. נוסף על כך, מדמיינים את המיטוכונדריה בעזרת צבעים או נוגדנים ספציפיים. גידול תאים בפורמט רב-באר ושימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטי מקלים על חקר הדינמיקה של mtDNA והמורפולוגיה של המיטוכונדריה במגוון תנאי ניסוי בזמן קצר יחסית.
Introduction
עבור רוב התאים האיקריוטים, מיטוכונדריה הם אברונים חיוניים, שכן הם ממלאים תפקיד מכריע בתהליכים תאיים רבים. בראש ובראשונה, מיטוכונדריה הם ספקי האנרגיה העיקריים של תאים1. מיטוכונדריה מעורבים גם בוויסות הומאוסטזיס תאי (לדוגמה, חמצון-חיזור תוך-תאי2 ומאזן הסידן3), איתות תאי 4,5, אפופטוזיס6, סינתזה של תרכובות ביוכימיות שונות7,8, והתגובה החיסונית המולדת9. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה קשור למצבים פתולוגיים שונים ולמחלות אנושיות....
Protocol
1. הכנת תערובת siRNA
- יום לפני תחילת הניסוי, תאי זרע (למשל, HeLa) על צלחת של 100 מ"מ, כך שהם מגיעים למפגש של 70%-90% למחרת.
הערה: כל הפעולות חייבות להתבצע בתנאים סטריליים בתא זרימה למינרי. - הכינו את הכמות המתאימה של siRNA מדולל לריכוז של 140 ננומטר בתווך Opti-MEM (ראו טבלת חומרים). צלח.......
Representative Results
סכימה של ההליך לחקר התפוקה הגבוהה של הדינמיקה של סינתזה והפצה של mtDNA מוצגת באיור 1. השימוש בפורמט של צלחת מרובת בארות מאפשר ניתוח סימולטני של תנאי ניסוי רבים ושונים, כגון השתקה של גנים שונים באמצעות ספריית siRNA. התנאים המשמשים לתיוג של מולקולות דנ"א מסונתזות חדשות עם BrdU מאפשר?.......
Discussion
מבחינה היסטורית, תיוג DNA על ידי שילוב BrdU וזיהוי נוגדנים שימש בשכפול DNA גרעיני ומחקר מחזור התא 14,27,28. עד כה, כל הפרוטוקולים לזיהוי DNA המסומן ב- BrdU כללו שלב דנטורציה של DNA (חומצי או תרמי) או עיכול אנזים (DNase או פרוטאינאז) כדי לאפשר חשיפה לאפיטופים .......
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המרכז הלאומי למדע, פולין (מספר מענק/פרס: 2018/31/D/NZ2/03901).
....Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,3′-Dideoxycytidine (ddC) | Sigma-Aldrich | D5782 | |
| 384 Well Cell Culture Microplates, black | Greiner Bio-One | #781946 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | B5002-1G | Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling. |
| Adhesive sealing film | Nerbe Plus | 04-095-0060 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21426 | |
| BioTek 405 LS microplate washer | Agilent | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Cell counting chamber Thoma | Heinz Herenz | REF:1080339 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Cytiva | SH30243.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635 | Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323 | |
| IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody | Progen | #61014 | |
| LightCycler 480 System | Roche | ||
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | #13778150 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | Mitochondria tracking dye |
| Multidrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Orca-R2 (C10600) CCD Camera | Hamamatsu | ||
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100ML | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| qPCR primer Fw B2M (reference) | CAGGTACTCCAAAGATTCAGG | ||
| qPCR primer Fw GPI (reference gene) | GACCTTTACTACCCAGGAGA | ||
| qPCR primer Fw MT-ND1 | TAGCAGAGACCAACCGAACC | ||
| qPCR primer Fw POLG | TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC | ||
| qPCR primer Fw TFAM | GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT | ||
| qPCR primer Fw TWNK | GCCATGTGACACTGGTCATT | ||
| qPCR primer Rev B2M (reference) | GTCAACTTCAATGTCGGATGG | ||
| qPCR primer Rev GPI (reference gene) | AGTAGACAGGGCAACAAAGT | ||
| qPCR primer Rev MT-ND1 | ATGAAGAATAGGGCGAAGGG | ||
| qPCR primer Rev POLG | GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG | ||
| qPCR primer Rev TFAM | GGACTTCTGCCAGCATAATA | ||
| qPCR primer Rev TWNK | AACATTGTCTGCTTCCTGGC | ||
| ScanR microscope | Olympus | ||
| siRNA Ctrl | Dharmacon | D-001810-10-5 | |
| siRNA POLG | Invitrogen | POLGHSS108223 | |
| siRNA TFAM | Invitrogen | TFAMHSS144252 | |
| siRNA TWNK | Invitrogen | C10orf2HSS125597 | |
| Suction device | NeoLab | 2-9335 | Suction device for cell culture |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| Trypsin | Biowest | L0931-500 | |
| UPlanSApo 20x 0.75 NA objective | Olympus |
References
- Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. The Biochemical Journal. 284, 1-13 (1992).
- Zhang, L., et al. Biochemical basis and metabolic interplay of redox regulation....
Reprints and Permissions
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved