Высокопроизводительная количественная оценка синтеза и распределения митохондриальной ДНК на основе изображений

Summary

Описана процедура изучения динамики метаболизма митохондриальной ДНК (мтДНК) в клетках с использованием формата многолуночного планшета и автоматизированной иммунофлуоресцентной визуализации для обнаружения и количественной оценки синтеза и распределения мтДНК. Это может быть дополнительно использовано для исследования влияния различных ингибиторов, клеточных стрессов и подавления генов на метаболизм мтДНК.

Abstract

Подавляющее большинство клеточных процессов требует непрерывного снабжения энергией, наиболее распространенным переносчиком которой является молекула АТФ. Эукариотические клетки производят большую часть своего АТФ в митохондриях путем окислительного фосфорилирования. Митохондрии являются уникальными органеллами, потому что у них есть собственный геном, который реплицируется и передается следующему поколению клеток. В отличие от ядерного генома, в клетке есть несколько копий митохондриального генома. Детальное изучение механизмов, ответственных за репликацию, восстановление и поддержание митохондриального генома, имеет важное значение для понимания правильного функционирования митохондрий и целых клеток как в нормальных, так и в болезненных условиях. Здесь представлен метод, позволяющий с высокой пропускной способностью количественно определять синтез и распределение митохондриальной ДНК (мтДНК) в клетках человека, культивируемых in vitro . Этот подход основан на иммунофлуоресцентном обнаружении активно синтезируемых молекул ДНК, меченных включением 5-бром-2'-дезоксиуридина (BrdU), и одновременном обнаружении всех молекул мтДНК с анти-ДНК-антителами. Кроме того, митохондрии визуализируются с помощью специфических красителей или антител. Культивирование клеток в многолуночном формате и использование автоматизированного флуоресцентного микроскопа облегчают изучение динамики мтДНК и морфологии митохондрий в различных экспериментальных условиях за относительно короткое время.

Introduction

Для большинства эукариотических клеток митохондрии являются важными органеллами, поскольку они играют решающую роль во многих клеточных процессах. Прежде всего, митохондрии являются ключевыми поставщиками энергии для клеток¹. Митохондрии также участвуют в регуляции клеточного гомеостаза (например, внутриклеточный окислительно-восстановительный^{потенциал 2} и кальциевый баланс³), клеточной сигнализации ^4,5, апоптозе⁶, синтезе различных биохимических соединений ^7,8 и врожд....

Protocol

1. Приготовление смеси миРНК

1. За день до начала эксперимента семенные клетки (например, HeLa) помещают в чашку диаметром 100 мм так, чтобы на следующий день они достигли слияния 70%-90%.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все операции должны проводиться в стерильных условиях в ламинарной проточной кам?.......

Discussion

Исторически сложилось так, что маркировка ДНК путем включения BrdU и обнаружения антител использовалась в репликации ядерной ДНК и исследованиях клеточного цикла 14,27,28. До сих пор все протоколы для обнаружения ДНК, меченной BrdU, включали ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2′,3′-Dideoxycytidine (ddC)	Sigma-Aldrich	D5782
384  Well Cell Culture Microplates, black	Greiner Bio-One	#781946
5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU)	Sigma-Aldrich	B5002-1G	Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling.
Adhesive sealing film	Nerbe Plus	04-095-0060
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	A-21121
Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	A-21426
BioTek 405 LS microplate washer	Agilent
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503
Cell counting chamber Thoma	Heinz Herenz	REF:1080339
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Cytiva	SH30243.01
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	41965-062
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	10270-106
Formaldehyde solution	Sigma-Aldrich	F1635	Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully.
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-32323
IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody	Progen	#61014
LightCycler 480 System	Roche
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	#13778150
MitoTracker Deep Red FM	Thermo Fisher Scientific	M22426	Mitochondria tracking dye
Multidrop Combi Reagent Dispenser	Thermo Fisher Scientific
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	51985-042
Orca-R2 (C10600) CCD Camera	Hamamatsu
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781-100ML
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
PowerUp SYBR Green Master Mix	Thermo Fisher Scientific	A25742
qPCR primer Fw B2M (reference)			CAGGTACTCCAAAGATTCAGG
qPCR primer Fw GPI (reference gene)			GACCTTTACTACCCAGGAGA
qPCR primer Fw MT-ND1			TAGCAGAGACCAACCGAACC
qPCR primer Fw POLG			TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC
qPCR primer Fw TFAM			GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT
qPCR primer Fw TWNK			GCCATGTGACACTGGTCATT
qPCR primer Rev B2M (reference)			GTCAACTTCAATGTCGGATGG
qPCR primer Rev GPI (reference gene)			AGTAGACAGGGCAACAAAGT
qPCR primer Rev MT-ND1			ATGAAGAATAGGGCGAAGGG
qPCR primer Rev POLG			GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG
qPCR primer Rev TFAM			GGACTTCTGCCAGCATAATA
qPCR primer Rev TWNK			AACATTGTCTGCTTCCTGGC
ScanR microscope	Olympus
siRNA Ctrl	Dharmacon	D-001810-10-5
siRNA POLG	Invitrogen	POLGHSS108223
siRNA TFAM	Invitrogen	TFAMHSS144252
siRNA TWNK	Invitrogen	C10orf2HSS125597
Suction device	NeoLab	2-9335	Suction device for cell culture
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML
Trypsin	Biowest	L0931-500
UPlanSApo 20x 0.75 NA objective	Olympus