Justering af optisk kohærenstomografi i synligt lys med konfokale billeder af samme musenethinde

Summary

Denne protokol skitserer trinnene til justering af in vivo optisk kohærenstomografi i synligt lys (vis-OCTF) billeder med ex vivo konfokale billeder af samme musenethinde med det formål at verificere den observerede retinale ganglioncelleaxonbundtmorfologi i in vivo-billederne.

Abstract

I de senere år er in vivo retinal billeddannelse, som giver ikke-invasiv, realtid og langsgående information om biologiske systemer og processer, i stigende grad blevet anvendt til at opnå en objektiv vurdering af neurale skader i øjensygdomme. Ex vivo konfokal billeddannelse af den samme nethinden er ofte nødvendig for at validere in vivo fund, især i dyreforsøg. I denne undersøgelse demonstrerede vi en metode til at justere et ex vivo konfokal billede af musens nethinde med dets in vivo-billeder . En ny klinisk klar billeddannelsesteknologi kaldet synligt lys optisk kohærenstomografi fibergrafi (vis-OCTF) blev anvendt til at erhverve in vivo-billeder af musens nethinden. Vi udførte derefter den konfokale billeddannelse af den samme nethinde som "guldstandarden" for at validere in vivo vis-OCTF-billederne. Denne undersøgelse muliggør ikke kun yderligere undersøgelse af de molekylære og cellulære mekanismer, men etablerer også et fundament for en følsom og objektiv evaluering af neurale skader in vivo.

Introduction

Retinale ganglionceller (RGC'er) spiller en kritisk rolle i visuel informationsbehandling, modtager synaptiske input gennem deres dendritiske træer i det indre plexiformlag (IPL) og transmitterer informationen via deres axoner i retinale nervefiberlag (RNFL) til hjernen 1,2,3,4. Ved syge tilstande som glaukom kan tidlig RGC-degeneration resultere i subtile ændringer i RNFL, ganglioncellelaget (GCL), IPL og synsnerven hos både patienter og gnavermodeller 5,6,7,8,9.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Virginia og i overensstemmelse med retningslinjen om brug af dyr fra National Institute of Health (NIH). Se materialefortegnelsen for detaljer vedrørende alle materialer, reagenser og instrumenter, der anvendes i denne protokol.

1. In vivo i forhold til OLT-billeddannelse

1. Forholdet mellem de oversøiske lande og territorier (OLT)
   1. Tag bille.......

Discussion

Der er to trin i denne protokol, der kræver opmærksomhed. For det første er det nødvendigt at sikre, at dyret er under dyb anæstesi, og at deres øjne er fuldt udvidede inden vis-OCT-billeddannelse. Hvis musene ikke bedøves tilstrækkeligt, kan deres hurtige vejrtrækning føre til ustabile bevægelser af ansigtsbillederne , hvilket kan påvirke fibergrammets kvalitet negativt. Desuden kan utilstrækkelig udvidelse også have en negativ indvirkning på billedkvaliteten, da iris kan blokere lyset og forhind.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Halo 100	Opticent Health, Evanston, IL
Zeiss LSM800 microscope	Carl Zeiss
Drugs and antibodies
4% paraformaldehyde (PFA)	Santz Cruz Biotechnology, SC-281692		1-2 drops
Bovine serum albumin powder	Fisher Scientific, BP9706-100		1:10
Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye	Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202		1:1,000
Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye	Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209		1:1,000
Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL))	Covetrus, NDC 11695-4860-1		15.6 mg/mL
Ketamine	Covetrus, NADA043304		114 mg/kg
Mouse anti-Tuj1	A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia		1:200
Normal donkey serum(NDS)	Millipore Sigma, S30-100 mL		1:100
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4 (Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4)	Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3		1:10
Rat anti-ICAM-2	BD Pharmingen, Cat#553325		1:500
Tropicamide drops	Covetrus, NDC17478-102-12
Triton X-100 (Reagent Grade)	VWR, CAS: 9002-93-1		1:20
Vectashield mounting medium	Vector Laboratories Inc. H2000-10
Xylazine	Covetrus, NDC59399-110-20		17 mg/kg