Allineamento di fibrogrammi per tomografia a coerenza ottica a luce visibile con immagini confocali della stessa retina murina

Summary

Il presente protocollo delinea i passaggi per l'allineamento in vivo delle immagini in fibra di tomografia a coerenza ottica a luce visibile (vis-OCTF) con le immagini confocali ex vivo della stessa retina murina allo scopo di verificare la morfologia osservata del fascio assonale delle cellule gangliari retiniche nelle immagini in vivo .

Abstract

Negli ultimi anni, l'imaging retinico in vivo, che fornisce informazioni non invasive, in tempo reale e longitudinali sui sistemi e sui processi biologici, è stato sempre più applicato per ottenere una valutazione obiettiva del danno neurale nelle malattie oculari. L'imaging confocale ex vivo della stessa retina è spesso necessario per convalidare i risultati in vivo , soprattutto nella ricerca sugli animali. In questo studio, abbiamo dimostrato un metodo per allineare un'immagine confocale ex vivo della retina del topo con le sue immagini in vivo . Una nuova tecnologia di imaging clinicamente pronta chiamata fibragrafia per tomografia a coerenza ottica a luce visibile (vis-OCTF) è stata applicata per acquisire immagini in vivo della retina del topo. Abbiamo quindi eseguito l'imaging confocale della stessa retina come "gold standard" per convalidare le immagini in vivo vis-OCTF. Questo studio non solo consente ulteriori indagini sui meccanismi molecolari e cellulari, ma stabilisce anche le basi per una valutazione sensibile e obiettiva del danno neurale in vivo.

Introduction

Le cellule gangliari retiniche (RGC) svolgono un ruolo fondamentale nell'elaborazione delle informazioni visive, ricevendo input sinaptici attraverso i loro alberi dendritici nello strato plessiforme interno (IPL) e trasmettendo le informazioni tramite i loro assoni nello strato di fibre nervose retiniche (RNFL) al cervello 1,2,3,4. In condizioni patologiche come il glaucoma, la degenerazione precoce di RGC può provocare sottili cambiamenti nell'RNFL, nello strato di cellule gangliari (GCL), nell'IPL e nel nervo ottico ....

Protocol

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università della Virginia e conformi alle linee guida sull'uso degli animali del National Institute of Health (NIH). Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti e gli strumenti utilizzati in questo protocollo.

1. Imaging vis-OCT in vivo

1. Il sistema vis-OCT
   1. Immagina gli occhi dei topi .......

Discussion

Ci sono due passaggi in questo protocollo che richiedono attenzione. Innanzitutto, è necessario assicurarsi che l'animale sia in anestesia profonda e che i suoi occhi siano completamente dilatati prima dell'imaging vis-OCT. Se i topi non sono adeguatamente anestetizzati la loro respirazione veloce può portare a movimenti instabili delle immagini en face , che possono influire negativamente sulla qualità del fibrogramma. Inoltre, una dilatazione insufficiente può anche avere un impatto negativo sulla qualità.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Halo 100	Opticent Health, Evanston, IL
Zeiss LSM800 microscope	Carl Zeiss
Drugs and antibodies
4% paraformaldehyde (PFA)	Santz Cruz Biotechnology, SC-281692		1-2 drops
Bovine serum albumin powder	Fisher Scientific, BP9706-100		1:10
Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye	Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202		1:1,000
Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye	Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209		1:1,000
Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL))	Covetrus, NDC 11695-4860-1		15.6 mg/mL
Ketamine	Covetrus, NADA043304		114 mg/kg
Mouse anti-Tuj1	A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia		1:200
Normal donkey serum(NDS)	Millipore Sigma, S30-100 mL		1:100
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4 (Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4)	Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3		1:10
Rat anti-ICAM-2	BD Pharmingen, Cat#553325		1:500
Tropicamide drops	Covetrus, NDC17478-102-12
Triton X-100 (Reagent Grade)	VWR, CAS: 9002-93-1		1:20
Vectashield mounting medium	Vector Laboratories Inc. H2000-10
Xylazine	Covetrus, NDC59399-110-20		17 mg/kg