Alineación de figramas de tomografía de coherencia óptica en luz visible con imágenes confocales de la misma retina de ratón

Summary

El presente protocolo describe los pasos para alinear las imágenes de fibragrafía de tomografía de coherencia óptica en luz visible (vis-OCTF) in vivo con imágenes confocales ex vivo de la misma retina de ratón con el fin de verificar la morfología del haz de axones de las células ganglionares de la retina observada en las imágenes in vivo .

Abstract

En los últimos años, la imagen de la retina in vivo , que proporciona información no invasiva, en tiempo real y longitudinal sobre los sistemas y procesos biológicos, se ha aplicado cada vez más para obtener una evaluación objetiva del daño neuronal en las enfermedades oculares. A menudo se necesitan imágenes confocales ex vivo de la misma retina para validar los hallazgos in vivo , especialmente en la investigación con animales. En este estudio, demostramos un método para alinear una imagen confocal ex vivo de la retina del ratón con sus imágenes in vivo . Se aplicó una nueva tecnología de imagen clínicamente preparada llamada figrafía de tomografía de coherencia óptica de luz visible (vis-OCTF) para adquirir imágenes in vivo de la retina del ratón. A continuación, realizamos la obtención de imágenes confocales de la misma retina que el "estándar de oro" para validar las imágenes in vivo vis-OCTF. Este estudio no solo permite una mayor investigación de los mecanismos moleculares y celulares, sino que también sienta las bases para una evaluación sensible y objetiva del daño neuronal in vivo.

Introduction

Las células ganglionares de la retina (CGR) desempeñan un papel fundamental en el procesamiento de la información visual, recibiendo entradas sinápticas a través de sus árboles dendríticos en la capa plexiforme interna (IPL) y transmitiendo la información a través de sus axones en la capa de fibras nerviosas de la retina (RNFL) al cerebro 1,2,3,4. En enfermedades como el glaucoma, la degeneración temprana de RGC puede dar lugar a cambios sutiles en el RNFL, la capa de células ganglionares (LCG), la LPI y el nervio óptic....

Protocol

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Virginia y se ajustaron a la directriz sobre el uso de animales del Instituto Nacional de Salud (NIH). Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, reactivos e instrumentos utilizados en este protocolo.

1. Imágenes in vivo vis-OCT

1. El sistema vis-OCT
   1. Imagi.......

Discussion

Hay dos pasos en este protocolo que requieren atención. En primer lugar, es necesario asegurarse de que el animal esté bajo anestesia profunda y que sus ojos estén completamente dilatados antes de la obtención de imágenes por OCT. Si los ratones no están adecuadamente anestesiados, su respiración acelerada puede provocar movimientos inestables de las imágenes faciales , lo que puede afectar negativamente a la calidad del fitragrama. Además, una dilatación insuficiente también puede tener un impacto ne.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Halo 100	Opticent Health, Evanston, IL
Zeiss LSM800 microscope	Carl Zeiss
Drugs and antibodies
4% paraformaldehyde (PFA)	Santz Cruz Biotechnology, SC-281692		1-2 drops
Bovine serum albumin powder	Fisher Scientific, BP9706-100		1:10
Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye	Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202		1:1,000
Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye	Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209		1:1,000
Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL))	Covetrus, NDC 11695-4860-1		15.6 mg/mL
Ketamine	Covetrus, NADA043304		114 mg/kg
Mouse anti-Tuj1	A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia		1:200
Normal donkey serum(NDS)	Millipore Sigma, S30-100 mL		1:100
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4 (Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4)	Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3		1:10
Rat anti-ICAM-2	BD Pharmingen, Cat#553325		1:500
Tropicamide drops	Covetrus, NDC17478-102-12
Triton X-100 (Reagent Grade)	VWR, CAS: 9002-93-1		1:20
Vectashield mounting medium	Vector Laboratories Inc. H2000-10
Xylazine	Covetrus, NDC59399-110-20		17 mg/kg