Justering av optisk koherenstomografi i synligt ljus med konfokala bilder av samma musnäthinna

Summary

I detta protokoll beskrivs stegen för att anpassa in vivo-bilder med optisk koherenstomografifibergrafi (vis-OCTF) i synligt ljus med ex vivo konfokala bilder av samma musnäthinna i syfte att verifiera den observerade morfologin för näthinnans gangliecellsaxonbunt i in vivo-bilderna.

Abstract

Under de senaste åren har in vivo retinal avbildning, som ger icke-invasiv, realtids- och longitudinell information om biologiska system och processer, i allt högre grad tillämpats för att få en objektiv bedömning av nervskador vid ögonsjukdomar. Ex vivo konfokal avbildning av samma näthinna är ofta nödvändig för att validera in vivo-fynden, särskilt i djurförsök. I denna studie demonstrerade vi en metod för att anpassa en ex vivo konfokalbild av musens näthinna med dess in vivo-bilder. En ny klinisk avbildningsteknik som kallas synligt ljus optisk koherenstomografi fibergrafi (vis-OCTF) användes för att ta in vivo-bilder av musens näthinna. Vi utförde sedan den konfokala avbildningen av samma näthinna som "guldstandarden" för att validera in vivo vis-OCTF-bilderna. Denna studie möjliggör inte bara ytterligare undersökning av de molekylära och cellulära mekanismerna utan etablerar också en grund för en känslig och objektiv utvärdering av nervskador in vivo.

Introduction

Retinala ganglieceller (RGC) spelar en avgörande roll i visuell informationsbearbetning, tar emot synaptiska intryck genom sina dendritiska träd i det inre plexiforma skiktet (IPL) och överför informationen via sina axoner i retinala nervfiberskiktet (RNFL) till hjärnan 1,2,3,4. Vid sjukdomstillstånd som glaukom kan tidig RGC-degeneration resultera i subtila förändringar i RNFL, gangliecelskiktet (GCL), IPL och synnerven hos både patienter och gnagarmodeller 5,6,7,8,9.

Protocol

Alla djurförsök godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid University of Virginia och överensstämde med riktlinjerna för användning av djur från National Institute of Health (NIH). Se materialtabellen för detaljer relaterade till alla material, reagenser och instrument som används i detta protokoll.

1. In vivo i förhållande till OCT-avbildning

1. Vis-ULT-systemet
   1. Föreställ dig mössens ögon med hjälp av .......

Discussion

Det finns två steg i det här protokollet som kräver uppmärksamhet. För det första är det nödvändigt att se till att djuret är under djup bedövning och att ögonen är helt vidgade före ULT-avbildning. Om mössen inte är tillräckligt bedövade kan deras snabba andning leda till instabila rörelser i ansiktsbilderna , vilket kan påverka fibergrammets kvalitet negativt. Dessutom kan otillräcklig utvidgning också ha en negativ inverkan på bildkvaliteten eftersom iris kan hindra ljuset och hindra de.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Halo 100	Opticent Health, Evanston, IL
Zeiss LSM800 microscope	Carl Zeiss
Drugs and antibodies
4% paraformaldehyde (PFA)	Santz Cruz Biotechnology, SC-281692		1-2 drops
Bovine serum albumin powder	Fisher Scientific, BP9706-100		1:10
Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye	Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202		1:1,000
Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye	Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209		1:1,000
Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL))	Covetrus, NDC 11695-4860-1		15.6 mg/mL
Ketamine	Covetrus, NADA043304		114 mg/kg
Mouse anti-Tuj1	A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia		1:200
Normal donkey serum(NDS)	Millipore Sigma, S30-100 mL		1:100
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4 (Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4)	Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3		1:10
Rat anti-ICAM-2	BD Pharmingen, Cat#553325		1:500
Tropicamide drops	Covetrus, NDC17478-102-12
Triton X-100 (Reagent Grade)	VWR, CAS: 9002-93-1		1:20
Vectashield mounting medium	Vector Laboratories Inc. H2000-10
Xylazine	Covetrus, NDC59399-110-20		17 mg/kg