Forfatterne vil gjerne takke Maize Genetics Cooperation, Maize Cell Genomics Project, Dave Jackson (Cold Spring Harbor Laboratory, NY), Anne W. Sylvester (Marine Biological Laboratory, University of Chicago, IL), Andrea Gallavotti (Rutgers University, NJ), og Carolyn G. Rasmussen (University of California, Riverside) for å gi mutante og transgene aksjer, samt Robert F. Baker og Alexander Jurkevich fra Advanced Light Microscopy Core ved University of Missouri-Columbia for deres hjelp med konfokal mikroskopi. JMR ble støttet av J. William Fulbright Fellowship, The Diane P. og Robert E. Sharp Fund, og National Science Foundation's Plant Genome Research Program (IOS-1546873) til PM. CDTC, CMRV, EDCDP og RJRR støttes av Ateneo College Scholarship Program. CDTC, EDCDP og RJRR støttes av DOST-SEI S&T Undergraduate Scholarship. DODL støttes av Fr. Thomas Steinbugler SJ Academic Scholarship. RJRR støttes av Aiducation International-Pathways to Higher Education Scholarship. Dette arbeidet ble støttet av School of Science and Engineering og Rizal Library, Ateneo de Manila University.

Forbedrede metoder for avbildning av maisbladPrimordia

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.

Vi presenterer to metoder for å forberede maisbladprimordia for cellulær avbildning. Den første metoden (protokolldel 2) tillater måling av primordium for tverrsnittanalyse, mens den andre metoden (protokolldel 3) muliggjør utrulling og utflating av primordium for helmonteringsanalyse. Disse metodene letter cellulær avbildning av FPs i maisbladprimordia 24 (som vist i figur 4 og figur 5) og gir enkle løsninger på utfordringene med å avbilde utvikling av maisblader. Protokollseksjon 2 reduserer disseksjonstiden og forbedrer prøvetakingsnøyaktigheten ved å måle primordiene før seksjonering i stedet for å stole utelukkende på stagingparametere 9,16. Med kommersielt tilgjengelig nanotape løser protokollseksjon 3 det langvarige problemet med avbildning av helbladprimordia i mais. Denne protokollen forbedrer den forrige metoden, som brukte dialyserør 31, og er et mye billigere alternativ til CT og MR11,32,33. Men når det gjelder å visualisere bladanatomiske egenskaper og produsere optimale resultater, har begge protokollene noen begrensninger, som er skissert i tabell 2 og diskuteres mer detaljert nedenfor.
I protokolldel 2 opplevde vi problemer med å visualisere cellekonturer i tykke tverrsnitt av bladprimordiene, og motfarging med cellevegg- eller plasmamembranbindende fluorescerende fargestoffer ga ikke tilfredsstillende resultat. For eksempel ga FM 4-64 suboptimale resultater sammenlignet med plasmamembranen FP-markøren, pZmPIP2-1::ZmPIP2-1:CFP39 (PIP2-1-CFP; Figur 3A-D). For å overvinne denne begrensningen anbefaler vi å bruke en vibratome for å produsere tynnere vevsseksjoner (~0,1 mm)58 som vil muliggjøre en levende lysfeltavbildning av cellekonturer eller optimalisere motfargingsprotokollen47,59.
I protokollseksjon 3 er hovedbegrensningen vanskeligheten med å montere bladet uten å rive, skade eller luftbobler, som beskrevet i protokolltrinn 3.2.5-3.2.6 (figur 3E-K). Fordi maisbladet er bilateralt symmetrisk, kan et halvbladfeste i stedet for et helbladfeste være tilstrekkelig for visualisering9. For å gjøre dette kan primordiumet kuttes med et barberblad langs lengdeaksen etter å ha rullet det opp til midribben, slik at bare halvparten av bladet kan monteres. En annen begrensning ved protokollseksjon 3 er at tykkelsen på bladet kan begrense den optiske oppløsningen av fluoroforsignalet under dyp avbildning. For å løse dette problemet er det mulig å bruke en vevsryddingsteknikk60. Vi fant imidlertid ut at ClearSee61, et vanlig brukt clearingreagens for avbildning av plantevev, ikke er kompatibelt med protokollen fordi det får prøven og dekselet til å løsne fra nanobåndet. En potensiell løsning på dette problemet kan være å påføre en semipermeabel membran31 over bladprøven, slik at den kan behandles med ryddeløsningen mens den holdes på plass av nanobåndet. En slik metode som gjør det mulig å bruke flytende løsninger på det utrullede bladet, kan også brukes til helmontert RNA in situ-hybridisering og immunlokaliseringsteknikker, som tidligere har blitt optimalisert for å utvikle maisblomstrer, men ikke for helbladet primordia62,63.
Vi beskrev protokoller for mais, som har store bladprimordier selv på plantestadiet. Andre gressarter med mye mindre bladprimordia, som ris, bygg, hvete, Setaria og Brachypodium 16,23,64,65,66, kan kreve bruk av ekstra presisjonsverktøy for effektivt å anvende disse protokollene. Videre var disse protokollene ikke ment for levende celleavbildning, som fanger sanntids dynamiske prosesser for vevsdannelse og cellulære responser. Men som fluorescerende prober, bildebehandlingsteknologier og databehandlingsevner fortsetter å utvikle seg i levende celleavbildning for planter67, kan fremtidig forskning bygge på disse protokollene for å utvikle levende celleavbildningsstrategier skreddersydd for de unike egenskapene til gressbladprimordia.

Gressavlinger er en viktig kilde til mat og biodrivstoff for den globale befolkningen1, og forbedring av bladanatomi har potensial til å øke produktiviteten 2,3. Vår nåværende forståelse av hvordan bladanatomi reguleres i gress er imidlertid begrenset4 og krever analyse av bladprimordia, da mange anatomiske og fysiologiske egenskaper ved bladet er forhåndsbestemt tidlig i utviklingen 5,6,7. Cellulære bildebehandlingsteknikker, som fluorescens og konfokal avbildning, er uunnværlige for å studere gressbladanatomi og cellulære egenskaper, men disse teknikkene er vanskelige å bruke på gressbladprimordia fordi de er dypt omsluttet og rullet i bladhvirvelen. Vi løste dette problemet ved å utvikle metoder for å forberede tverrsnitt og utrullede helbladfester for fluorescens og konfokal analyse av maisbladprimordia, et modellsystem for å studere gressbladanatomi og utvikling 2,8.
Maisbladet, som alle gressblader, består av et stroppelignende blad med en kappe som vikler seg rundt stilken og utvikler skudd 9,10,11,12,13. Bladene utvikler seg fra skuddet apikale meristem (SAM) i et distichous mønster, hvor hvert nytt blad starter i motsatt posisjon av det forrige bladet, noe som resulterer i to rekker av blader langs den vertikale aksen (figur 1A) 14 . Utviklingsstadiet til hvert bladprimordium identifiseres ved dets posisjon i forhold til SAM, med nærmeste primordium betegnet som plastochron1 (P1) og følgende primordia betegnet som P2, P3 og så videre (figur 1B, C) 2. Under utviklingen (figur 1D) vises bladprimordiet først som en halvmåneformet støtte rundt bunnen av SAM (P1), og vokser deretter til et hetteformet primordium som strekker seg over meristem (P2)9,10,11. De basale kantene av hetten ekspanderer deretter sideveis og overlapper hverandre når spissen vokser oppover og danner et kjegleformet primordium (P3-P5)10. Primordium vokser da raskt i lengde, og slirebladgrensen ved basen blir mer fremtredende med dannelsen av ligulen, den frynselignende projeksjonen på bladets adaksiale side (P6/P7). Til slutt ruller bladet ut når det kommer ut av hvirvelen under steady-state vekst, hvor de delende cellene er begrenset innenfor den lille basale regionen av bladet, og danner en gradient med ekspanderende og differensierende celler langs den proksimal-distale aksen (P7 / P8) 15. Skuddspissen til en maisplante inneholder flere primordier på forskjellige utviklingsstadier, noe som gjør den til en utmerket modell for å studere bladutvikling8.
Nøyaktig analyse av tidlig bladutvikling krever staging eller bruk av standardiserte kriterier for å definere forskjellige stadier av primordiumutvikling i forhold til andre vekst- eller morfologiske parametere. Fordi bladprimordiene er skjult i gressskuddet, bruker forskere vanligvis parametere som plantens alder eller størrelsen på de fremvoksende bladene som prediktorer for stadiene og størrelsene på bladprimordia 9,16. I mais bestemmes plantens kronologiske alder enten av antall dager etter planting eller spiring (DAP/DAG)17,18. Det vegetative stadiet (V-trinnet) bestemmes av det øverste bladet med en synlig krage, en blek linje på den abaksiale siden mellom bladet og skjeden som tilsvarer posisjonen til ligule og auriklene, et par kileformede områder ved bunnen av bladet (figur 1A,B)17,19 . Mellom 20 og 25 DAG går SAM over i en blomsterstandsmeristem og slutter å produsere nye blader20. Vekstratene for maisbladprimordia kan variere avhengig av miljøet og genotypen til planten. Av denne grunn kan plantealder og størrelsen på de fremvoksende bladene ikke nøyaktig forutsi størrelsene på bladprimordia; Imidlertid kan bruk av disse parametrene bidra til å forutsi rekkevidden av Primordia-stadier og størrelser for eksperimentelle formål.
Tverrsnittsanalyse er en populær metode for å undersøke bladanatomi og utvikling i mais og andre gress fordi det muliggjør prøvetaking av flere plastokroner i en enkelt seksjon over skuddet21,22,23. Denne metoden er også praktisk for cellulær avbildning av ferske prøver, da de omkringliggende bladene fungerer som et stillas som holder bladprimordia på plass under seksjonering og montering24. En ulempe med denne metoden er imidlertid at det kan være utfordrende å nøyaktig lokalisere målplastokronen og regionen innenfor primordiet ved snitting fra et intakt skudd. Videre, fordi bladveksten varierer mellom plastokroner og langs den proksimal-distale aksen2,5, kan upresis prøvetaking resultere i en feil tolkning av utviklingsstadiet og regionen av primordium i et gitt avsnitt. Derfor er utvikling av en metode for presis tverrsnittsprøvetaking avgjørende for å sikre nøyaktigheten og reproduserbarheten av anatomiske og utviklingsmessige analyser av gressbladprimordia.
Helbladmonteringsanalyse muliggjør omfattende og integrativ undersøkelse av vev og cellulære prosesser som forekommer på hele organskalaen, for eksempel proliferativ vekst25 og venemønster26,27,28. Metoden gir en paradermal oversikt over bladet, slik at det oppdages forskjellige prosesser og mønstre som ellers ville være vanskelig å oppdage ved hjelp av tverrsnittanalyse24,27. I motsetning til i Arabidopsis, hvor det allerede er etablerte metoder for avbildning av helbladfester29,30, er det for tiden ingen standardmetode for avbildning av utrullede helbladfester i gress. En tidligere protokoll for utrulling av isolert maisbladprimordia involverte uvanlige materialer og var ikke egnet for cellulær avbildning31. Avanserte bildebehandlingsteknikker, som computertomografi (CT) og magnetisk resonansavbildning (MRI), kan skaffe 3D-anatomisk informasjon uten å isolere og rulle ut primordia 11,32,33, men de er dyre og krever spesialutstyr. Å utvikle en teknikk for å overvinne begrensningene pålagt av den rullede og koniske morfologien til bladprimordia i mais og andre gress, ville fremme undersøkelser av deres anatomiske og utviklingsmessige egenskaper.
Her presenterer vi metoder for å forberede tverrsnitt og utrullede hele fester av maisbladprimordia for fluorescens og konfokal avbildning. Vi brukte disse metodene til å kvantifisere veneantall og kartlegge den romlige-temporale hormonfordelingen i maisbladprimordia med fluorescerende proteiner (FPs)24. Den første metoden innebærer å fjerne den øvre delen av eldre blader fra maisplanter med en trådstripper (figur 1E). Ved å eksponere spissen av primordium (P5-P7), blir det mulig å bestemme lengden uten å måtte fjerne de eldre omkringliggende bladene helt, og dermed muliggjøre enkel og nøyaktig seksjonering. Den andre metoden innebærer å rulle ut og montere helbladprimordia (P3-P7) med klar, dobbeltsidig nanotape (figur 1F). Disse metodene er egnet for å visualisere forskjellige FPs24, men trenger optimalisering for bruk av fluorescerende fargestoffer og rydding av reagenser. I tillegg skisserer vi noen prosedyrer for sammenslåing av z-stabler, sammenslåing av bilder og sammenslåing av kanaler i ImageJ/FIJI34, som gjelder for bildene produsert av de to metodene. Disse metodene er nyttige for rutinemessig fluorescens eller konfokal avbildning av maisblader, men de kan også tilpasses for andre modellgressarter, som ris, Setaria og Brachypodium.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig01.jpg"> Figur 1: Organisering og morfologi av maisbladprimordier og oversikt over metodene . (A) Skjematisk fremstilling av en maisplante. Mais har en distichous phyllotaxy, med det nye bladet initiere på motsatt posisjon av forrige blad. Bladnummeret angir den kronologiske rekkefølgen som bladene kom fra spiring (dvs. første blad, L1; andre blad, L2; tredje blad, L3; etc.). Hvert blad har et distalt blad og en basal kappe avgrenset av en krage som tilsvarer ligule og auricle. Det øverste bladet med kragen synlig angir vegetativt stadium. Frøplanten i dette eksemplet er på V2-trinnet, med L2-kragen (pilspissen) synlig. Saksikonet indikerer stedet ved mesocotyl (me) der frøplanten må kuttes for å bli samlet. (B) Skjematisk fremstilling av dissekert opptak som viser isolert L1 til L4, med bladet primordia L5 til L9 vist som et forstørret bilde i (C). Gitokrontallet indikerer primordiums posisjon i forhold til SAM, med det yngste bladprimordium (P1) nærmest SAM og det eldre bladprimordiet (P2, P3, P4 og så videre) suksessivt lenger unna2. (D) Skjematisk fremstilling av morfologien til maisbladprimordia fra P1 til P5. (E) Skjematisk oversikt over metoden for tverrsnittsanalyse av maisbladet primordia. (1) Trim de eldre bladene med en trådstripper. (2) Mål primordium og seksjon skytingen. (3) Monter seksjonen på et lysbilde for avbildning og behandling (4, 5). (F) Skjematisk oversikt over metoden for helmontert analyse av maisbladet primordia. (1) Fjern de omkringliggende bladene for å trekke ut primordium. (2) Klipp ut og rull ut primordiumflaten på nanobåndet. (3) Monter prøven for avbildning og behandling (4, 5). Forkortelser: L = blad; bl = blad; sh = skjede; co = krage; meg = mesocotyl; V = vegetativ; P = plastokron; SAM = skyte apikal meristem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylic Gel Clear Double Sided Nano Tape 16.5 ft x 1.2 in, 2 mm thick</td>
			<td>EZlifego Store (Amazon)</td>
			<td>B07YB1ZXG6</td>
			<td>1 roll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bellucci Pick Curved micro probe 16.8 cm, 6.6 in</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>N1692 9</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clayman guide microprobe Sinskey hook angled shaft, 11.6 cm, 4.6 in</td>
			<td>Storz Opthalmic Instruments</td>
			<td>E0542</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Probe, Bent Needle, 14 cm (5.5 in)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>13553</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWELL 10-22 AWG Wire Stripper</td>
			<td>Dowell Store (Amazon)</td>
			<td>10-22 AWG</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Double Edge Carbon Steel Blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-9</td>
			<td>pkg/10; for fine sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted End Glass Microscope Slides, 75 mm x 25 mm x 1-1.2 mm</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260442</td>
			<td>pkg/144</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEM Single Edge, Stainless Steel Uncoated Blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-1</td>
			<td>box/200; for general cutting/sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI17904</td>
			<td>1 liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FIJI with EDF plugin (version 17.05.2021) and Grid/Collection Stitching plugin</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH) USA</td>
			<td>version 2.9.0/1.54s</td>
			<td>The EDF plugin was developed by Alex Prudencio, Jesse Berent, and Daniel Sage for the Biomedical Imaging Group, &#201;cole Polytechnique F&#233;d&#233;rale de Lausanne (EPFL; http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/). The grid/collection stitching software was developed by Stephan Preibisch for the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Ex-L Small 111.76 mm x 213.36 mm</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>34155</td>
			<td>box/280 ply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, 22 mm x 22 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260140</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PU Gel Clear Double Sided Nano Tape 29.5 ft x 1.18 in, 1 mm thick</td>
			<td>Yecaye Store (Amazon)</td>
			<td>L354 W1.18</td>
			<td>2 rolls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superslip Cover Glasses, 24 mm x 50 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260166</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superslip Cover Glasses, 24 mm x 60 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260168</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempered Glass Cutting Board</td>
			<td>Hacaroa (Amazon)</td>
			<td>B09XMXBT5S</td>
			<td>4 pc</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging

I mais (Zea mays) og andre gress (Poaceae) er bladprimordiene dypt innhyllet og rullet i bladhvirvelen, noe som gjør det vanskelig å studere tidlig bladutvikling. Her beskriver vi metoder for fremstilling av tverrsnitt og utrullede hele fester av maisbladprimordia for fluorescens og konfokal avbildning. Den første metoden bruker en trådstripper for å fjerne de øvre delene av eldre blader, utsette spissen av bladprimordium og tillate måling for mer nøyaktig tverrsnittprøvetaking. Den andre metoden bruker klar, dobbeltsidig nanotape for å rulle ut og montere helbladprimordia for avbildning. Vi viser nytten av de to metodene for å visualisere og analysere fluorescerende proteinreportere i mais. Disse metodene gir en løsning på utfordringene som den særegne morfologien til maisbladprimordia gir, og vil være nyttige for å visualisere og kvantifisere bladets anatomiske og utviklingsmessige egenskaper hos mais og andre gressarter.

Grass crops are a major source of food and biofuel for the global population1, and improving leaf anatomy has the potential to increase their productivity2,3. However, our current understanding of how leaf anatomy is regulated in grasses is limited4 and requires the analysis of leaf primordia, as many anatomical and physiological traits of the leaf are predetermined early in development5,6,7. Cellular imaging techniques, such as fluorescence and confocal imaging, are indispensable for studying grass leaf anatomy and cellular traits, but these techniques are difficult to apply to grass leaf primordia because they are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl. We addressed this issue by developing methods for preparing transverse sections and unrolled whole-leaf mounts for fluorescence and confocal analysis of maize leaf primordia, a model system for studying grass leaf anatomy and development2,8.
The maize leaf, like all grass leaves, consists of a strap-like blade with a sheath that wraps around the stem and developing shoot9,10,11,12,13. The leaves develop from the shoot apical meristem (SAM) in a distichous pattern, where each new leaf initiates in the opposite position of the previous leaf, resulting in two ranks of leaves along the vertical axis&#160;(Figure 1A)14 . The developmental stage of each leaf primordium is identified by its position relative to the SAM, with the closest primordium designated as plastochron1 (P1) and the following primordia designated as P2, P3, and so on (Figure 1B,C)2. During development (Figure 1D), the leaf primordium first appears as a crescent-shaped buttress around the base of the SAM (P1), and then grows into a hood-shaped primordium that extends over the meristem (P2)9,10,11. The basal margins of the hood then expand laterally and overlap each other as the tip grows upward, forming a cone-shaped primordium (P3-P5)10. The primordium then rapidly grows in length, and the sheath-blade boundary at the base becomes more prominent with the formation of the ligule, the fringe-like projection on the adaxial side of the leaf (P6/P7). Finally, the leaf unrolls as it emerges from the whorl during steady-state growth, in which the dividing cells are restricted within the small basal region of the blade, forming a gradient with expanding and differentiating cells along the proximal-distal axis (P7/P8)15. The shoot apex of a maize seedling contains multiple primordia at different stages of development, making it an excellent model for studying leaf development8.
Accurate analysis of early leaf development requires staging or the use of standardized criteria to define distinct stages of primordium development in relation to other growth or morphological parameters. Because the leaf primordia are hidden within the grass shoot, investigators typically use parameters such as the age of the plant or the size of the emerging leaves as predictors for the stages and sizes of the leaf primordia9,16. In maize, the chronological age of the plant is determined either by the number of days after planting or germination (DAP/DAG)17,18. The vegetative stage (V stage) is determined by the uppermost leaf with a visible collar, a pale line on the abaxial side between the blade and the sheath that corresponds to the position of the ligule and auricles, a pair of wedge-shaped regions at the base of the blade&#160;(Figure 1A,B)17,19 . Between 20 and 25 DAG, the SAM transitions into an inflorescence meristem and ceases to produce new leaves20. The growth rates of maize leaf primordia can vary depending on the environment and the genotype of the plant. For this reason, plant age and the size of the emerging leaves cannot accurately predict the sizes of leaf primordia; however, using these parameters can help predict the range of primordia stages and sizes for experimental purposes.
Transverse section analysis is a popular method for examining leaf anatomy and development in maize and other grasses because it allows for the sampling of multiple plastochrons in a single section across the shoot21,22,23. This method is also convenient for cellular imaging of fresh samples, as the surrounding leaves serve as a scaffold&#160;that keeps the leaf primordia in place during sectioning and mounting24. However, a disadvantage of this method is that it can be challenging to precisely locate the target plastochron and region within the primordium when sectioning from an intact shoot. Furthermore, because leaf growth varies across plastochrons and along the proximal-distal axis2,5, imprecise sampling could result in an incorrect interpretation of the developmental stage and region of the primordium in a given section. Therefore, developing a method for precise transverse section sampling is critical for ensuring the accuracy and reproducibility of anatomical and developmental analyses of grass leaf primordia.
Whole-leaf mount analysis enables the comprehensive and integrative investigation of tissue and cellular processes that occur at the whole-organ scale, such as proliferative growth25 and vein patterning26,27,28. The method provides a paradermal overview of the leaf, allowing the discovery of distinct processes and patterns that would otherwise be difficult to detect using transverse section analysis24,27. Unlike in Arabidopsis, where there are already established methods for imaging whole-leaf mounts29,30, there is currently no standard method for imaging unrolled whole-leaf mounts in grasses. A previous protocol for unrolling isolated maize leaf primordia involved uncommon materials and was not suitable for cellular imaging31. Advanced imaging techniques, such as computed tomography (CT) and magnetic resonance imaging (MRI), can acquire 3D anatomical information without isolating and unrolling the primordia11,32,33, but they are expensive and require specialized equipment. Developing a technique to overcome the constraints imposed by the rolled and conical morphology of leaf primordia in maize and other grasses would advance investigations into their anatomical and developmental traits.
Here, we present methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging. We used these methods to quantify vein number and map the spatial-temporal hormone distribution in maize leaf primordia with fluorescent proteins (FPs)24. The first method involves removing the upper portion of older leaves from maize seedlings with a wire stripper (Figure 1E). By exposing the tip of the primordium (P5-P7), it becomes possible to determine its length without having to completely remove the older surrounding leaves, thus enabling easy and accurate sectioning. The second method involves unrolling and mounting whole-leaf primordia (P3-P7) with clear, double-sided nano tape (Figure 1F). These methods are suitable for visualizing various FPs24&#160;but need optimization for using fluorescent dyes and clearing reagents. In addition, we outline some procedures for flattening z-stacks, stitching images, and merging channels in ImageJ/FIJI34, which apply to the images produced by the two methods. These methods are useful for routine fluorescence or confocal imaging of maize leaves, but they can also be adapted for other model grass species, such as rice, Setaria, and Brachypodium.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig01.jpg" /> 
Figure 1: Organization and morphology of maize leaf primordia and overview of the methods. (A) Schematic representation of a maize seedling. Maize has a distichous phyllotaxy, with the new leaf initiating at the opposite position of the previous leaf. The leaf number indicates the chronological order in which the leaves emerged from germination (i.e., first leaf, L1; second leaf, L2; third leaf, L3; etc.). Each leaf has a distal blade and a basal sheath delineated by a collar that corresponds to the ligule and auricle. The uppermost leaf with the collar visible denotes the vegetative stage. The seedling in this example is at the V2 stage, with the L2 collar (arrowhead) visible. The scissors icon indicates the location at the mesocotyl (me) where the seedling must be cut in order to be collected. (B) Schematic representation of the dissected shoot showing isolated L1 to L4, with the leaf primordia L5 to L9 shown as an enlarged image in (C). The plastochron number indicates the position of the primordium relative to the SAM, with the youngest leaf primordium (P1) closest to the SAM and the older leaf primordia (P2, P3, P4, and so on) successively farther away2. (D) Schematic representation of the morphology of maize leaf primordia from P1 to P5. (E) Schematic overview of the method for transverse section analysis of the maize leaf primordia. (1) Trim the older leaves with a wire stripper. (2) Measure the primordium and section the shoot. (3) Mount the section on a slide for imaging and processing (4, 5). (F) Schematic overview of the method for whole-mount analysis of the maize leaf primordia. (1) Remove the surrounding leaves to extract the primordium. (2) Cut and unroll the primordium flat on the nano tape. (3) Mount the sample for imaging and processing (4, 5). Abbreviations: L = leaf; bl = blade; sh = sheath; co = collar; me = mesocotyl; V = vegetative; P = plastochron; SAM = shoot apical meristem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Forfatter i søkelyset: Forbedrede metoder for klargjøring av tverrsnitt og utrullede hele fester av maisbladprimmordia for fluorescens og konfokal avbildning  

Forbedrede metoder for fremstilling av tverrsnitt og utrullede hele fester av maisbladprimordia for fluorescens og konfokal avbildning

Grasses like maize have leaf primordia grow within the shoot, making them difficult to study. We address this problem with improved protocols for preparing maize leaf transverse sections and whole mounts for fluorescence and confocal imaging. The first protocol uses a wire stripper to cut the older leaves, allowing the measurement of the primordium prior to sectioning.The second protocol uses clear, double-sided nano tape to unroll whole leaf primordium. These protocols improve the accuracy of transverse sectioning and enable unrolling of the leaf primordia, which have been very difficult to achieve due to their rolled, conical morphology. These methods will be useful for visualizing and quantifying leaf anatomical and developmental traits in maize and other grasses.Based on these methods, we plan to develop live cell imaging strategies to address questions in grass leaf development.

Tverrsnittsanalyse av maisblad primordia Vi brukte protokolldel 2 til å kvantifisere veneantall og karakterisere hormonresponsmønstre i tverrsnitt av maisbladprimordia med FPs (figur 4)24. For å vurdere rollen til plantehormonet auxin i bladvekst og venedannelse, kvantifiserte vi antall vener i bladprimordiene til en auxinmangelfull maismutant, forsvinnende dusk254. I tidlige plastokroner viser utviklingsårene tydelig cellularisering i mediancellelaget av maisbladet primordium21,22. Identifisering og telling av vener ved hjelp av konvensjonelle histologiske teknikker22 kan imidlertid være arbeidskrevende og tidkrevende. For å kvantifisere venene benyttet vi derfor maisauxin-effluksproteinmarkøren p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP41 (PIN1a-YFP heretter), som markerer utvikling av vener og prokambiale tråder (PCS; Figur 4A). Ved hjelp av protokolldel 2 kunne vi standardisere tverrsnittprøvetakingen ved å måle primordiene før snitting (figur 4B,C). Vi oppdaget en trend der vt2 har et bredere primordium og flere vener enn normalt (figur 4D,E)24, noe som stemmer overens med data fra fullt utvidede blad55, noe som indikerer at defekten i vt2 begynte tidlig i bladutviklingen. Ved hjelp av protokollseksjon 2 kunne vi også systematisk undersøke uttrykksmønstrene til hormonrespons FP-reportere i bladprimordia (se eksempler på bildene i figur 4F-I). Gjennom et standardisert tverrsnittsprøveskjema kartla vi fordelingen av auxin-, cytokinin- (CK) og gibberellsyre (GA) responser på tvers av forskjellige plastochroner og regioner av bladprimordia, og oppdaget nye responsmønstre som vi hypoteser har implikasjoner for bladvekst og venedannelse24. Derfor viser disse representative resultatene nytten av protokollseksjon 2 for tverrsnittsanalyse av maisbladprimordia.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig04.jpg"> Figur 4: Representative resultater for tverrsnittsanalyse av maisbladprimordia. (A-E) Kvantifisering av veneantall og primordiumbredde i bladprimordia av normal og forsvinnende dusk2 med auxin efflux proteinmarkør PIN1a-YFP. (A) Representative fluorescensbilder av tverrsnitt av P5 til P7 som uttrykker PIN1a-YFP i utviklingsårer og prokambiale tråder. De tverrgående seksjonene ble avbildet med et epifluorescensmikroskop ved hjelp av et FITC-filter (495-519 nm eksitasjon). Antall vener og primordiumbredden ble kvantifisert ved hjelp av flerpunkts- og frihåndslinjeverktøyene i henholdsvis FIJI/ImageJ. (B) En maisplante med de øvre bladhvirvlene fjernet med en trådstripper for å avsløre spissen av det fjerde bladet (L4). Braketten spenner over den projiserte primordiumlengden, med den stiplede linjen som indikerer midtlengden. (C) Skjematisk diagram av varierende primordiumformer fra P5 til P7, som illustrerer hvordan venenummer og primordiumbredde i midtlengden (horisontal stiplet linje) kan variere avhengig av utviklingsstadiet til primordium. (D,E) Måling av primordiumbredde (D) og venenummer (E) i midtlengdeseksjonen av L4 av normal og vt2. Trendlinjen representerer 10 mm rullerende gjennomsnitt av målinger ± standardfeil av gjennomsnittet (SEM). (F-I) Representative konfokale bilder av tverrsnitt av bladprimordia som uttrykker kombinasjoner av PIN1a-YFP, auxin response reporter, DR5-RFP, cytokinin response reporter, TCS-Tomato, gibberellic acid-responsive markør, GAR2-YFP, og mDII-Venus, en mutert versjon av auxin signaling input reporter DII-Venus. FP-kanalene legges oppå lysfeltkanalen i hvert bilde. Skala bar = 200 μm (A); 10 mm (B); 100 μm (F-I). Denne figuren er modifisert og gjengitt med tillatelse fra Robil og McSteen24. Forkortelser: DAG = dager etter spiring; P = plastokron; vt2 = forsvinnende dusk2; PCS = procambial streng; YFP = gult fluorescerende protein; FITC = fluoresceinisotiocyanat; RFP = rødt fluorescerende protein; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a: YFP; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; TCS-tomat = TCSv2::NLS-tdTomat; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2: YFP; mDII-Venus = pZmUbi:mDII:YFP-NLS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Helmonteringsanalyse av maisblad primordia Vi fulgte protokollseksjon 3 for å visualisere og analysere FP-uttrykk i helbladfester av maisbladprimordia (figur 5). Ved å visualisere venemønstre med PIN1a-YFP fant vi at dannelsen av vener forekommer i hele primordium under tidlige plastokroner, men denne prosessen blir begrenset i de proksimale regionene senere i utviklingen (figur 5A)24. Komplementært til tverrsnittanalysene har helbladsanalysene avdekket vevs- og stadiespesifikke mønstre av hormonrespons under venedannelse24. Et eksempel er uttrykksmønsteret til CK-responsreporteren TCSv2::NLS-tdTomato37 (TCS-Tomato), i forhold til PIN1a-YFP-uttrykk (figur 5B)24. Ved å følge protokolldel 3 kunne vi utføre både kvalitative og kvantitative analyser av FP-uttrykk i bladprimordiene (figur 5D-F; upubliserte data). Vi undersøkte uttrykksmønstrene til en auxin-responsreporter, DR5rev::mRFPer41 (DR5-RFP), og en GA-responsiv markør, pZmGAR2::ZmGAR2:YFP39 (GAR2-YFP), i helbladfester av enkle og doble mutanter av vt2 og dvergplante3 (d3), en GA-mangelfull mutant56 (figur 5D). Vi sammenlignet også de relative nivåene av celleproliferasjon mellom normal og vt2 bladprimordia ved hjelp av p Zm Cyclin-D2B :: ZmCyclin-D2B: YFP42 (Cyclin-D2B-YFP), som er en markør for G1 / S-overgangen i cellesyklusen57 (figur 5E, F). Selv om det ikke var noen signifikant forskjell mellom normal og vt2, var Cyclin-D2B-YFP-ekspresjon konsistent med den kjente celleproliferasjonsprofilen til tidlige plastokroner31. Vi konkluderer med at protokollseksjon 3 er en effektiv metode for å analysere hele fester av maisbladprimordia, som er vanskelige å avbilde på grunn av deres valsede morfologi.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig05.jpg"> Figur 5: Representative resultater for helmonteringsanalyse av maisbladprimordia. (A) Representative fluorescensbilder av bladprimordia av 7 DAG maisplanter som viser utviklende vener og kambiale tråder, som markert med auxin efflux proteinmarkør PIN1a-YFP. P3-P6 primordia ble skåret ut fra basen, rullet ut og flattrykt med adaksialsiden opp. Innfelte viser nærbilder av P3 og P4. I P5 og P6 avgrenser stiplede linjer den distale enden av de proliferative sonene, hvor flertallet av kambiale tråder fortsatt utvikler seg og strekker seg. (B,C) Representative konfokale bilder som viser uttrykket av PIN1a-YFP og cytokininresponsreporter, TCS-Tomato, i den proksimale marginale regionen av et P5 primordium. (D) Representative fluorescensbilder av P4 primordia som viser uttrykket av auxinresponsreporter, DR5-RFP, og gibberellsyre-responsiv markør, GAR2-YFP i normale og enkle og doble mutanter av forsvinnende dusk2 og dvergplante3. (E) Representative konfokale bilder av P3 og/eller P4 som viser uttrykket av Cyclin-D2B-YFP, en reporter for G1/S-overgangen i cellesyklusen. (F) Relative mengder celleproliferasjon i P3/P4 bladprimordia av normal og vt2, kvantifisert ved å måle den integrerte tettheten av Cyclin-D2B-YFP-signalet over arealet av primordium ved hjelp av ImageJ/FIJI. Stolpene representerer gjennomsnittsmålingene ± standardfeilen til gjennomsnittet. Skala bar = 500 μm (A,D,E); 200 μm (B); 100 μm (C). Figur 4A-C er modifisert og gjengitt med tillatelse fra Robil og McSteen24, mens figur 4D-F er upubliserte data fra forfatterne. Forkortelser: DAG = dager etter spiring; P = plastokron; vt2 = forsvinnende dusk2; d3 = dvergplante3; YFP = gult fluorescerende protein; RFP = rødt fluorescerende protein; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a: YFP; TCS-tomat = TCSv2::NLS-tdTomat; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2: YFP; Syklin-D2B-YFP = pZmSyklin-D2B::ZmSyklin-D2B:YFP; NS = ingen signifikant forskjell; au = vilkårlig enhet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Tilleggsfil 1: Eksempler på bladutviklingsstaging i maisplanter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239_S_File_1_Leaf_staging_maize_seedling_Fall2019%20(1).xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Tilleggsfigur S1: Planteprøver og materialer brukt i protokollene. (A,B) En maisplante 7-8 DAG med den øvre bladhvirvelen fjernet ved hjelp av en trådstripper. (B) Innfellingen viser et nærbilde av opptaket med det eksponerte P6 primordium. (VG Nett) Skudd av maisplanter med de øvre hvirvlene fjernet for tverrsnittanalyse (C,D) og omkringliggende blader helt fjernet for helmonteringsanalyse (E-G). (H) En rull med polyuretan gel klar dobbeltsidig nano tape. (I,J) P6 blad primordium (I) og proksimale regionen av P8 blad (J) rullet ut og montert på glass lysbilder med nano tape. (K) Et glassglass med et utrullet bladprimordium montert på scenen i et epifluorescensmikroskop. Forkortelse: DAG = dager etter spiring. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/S_FIGURE_1.pdf" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging at JoVE.com

Maisbladprimordia er dypt innhyllet og rullet, noe som gjør dem vanskelige å studere. Her presenterer vi metoder for å forberede tverrsnitt og utrullede hele fester av maisbladprimordia for fluorescens og konfokal avbildning.

In maize (Zea mays) and other grasses (Poaceae), the leaf primordia are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl, making it difficult to study ...

Gress som mais har bladprimordia vokse i skytingen, noe som gjør dem vanskelige å studere. Vi løser dette problemet med forbedrede protokoller for fremstilling av tverrsnitt av maisblader og hele fester for fluorescens og konfokal avbildning. Den første protokollen bruker en wirestripper for å kutte de eldre bladene, slik at måling av primordium før seksjonering.Den andre protokollen bruker klar, dobbeltsidig nanotape for å rulle ut hele bladprimordium. Disse protokollene forbedrer nøyaktigheten av tverrsnitt og muliggjør utrulling av bladprimordia, som har vært svært vanskelig å oppnå på grunn av deres rullede, koniske morfologi. Disse metodene vil være nyttige for å visualisere og kvantifisere bladets anatomiske og utviklingsmessige egenskaper i mais og andre gress.Basert på disse metodene planlegger vi å utvikle levende celleavbildningsstrategier for å løse spørsmål i gressbladutvikling.

Forbedrede metoder for fremstilling av tverrsnitt og utrullede hele fester av maisbladprimordia for fluorescens og konfokal avbildning

Abstract