Forfatterne vil gerne takke Maize Genetics Cooperation, Maize Cell Genomics Project, Dave Jackson (Cold Spring Harbor Laboratory, NY), Anne W. Sylvester (Marine Biological Laboratory, University of Chicago, IL), Andrea Gallavotti (Rutgers University, NJ) og Carolyn G. Rasmussen (University of California, Riverside) for at levere de mutante og transgene bestande samt Robert F. Baker og Alexander Jurkevich fra Advanced Light Microscopy Core ved University of Missouri-Columbia for deres hjælp med konfokal mikroskopi. JMR blev støttet af J. William Fulbright Fellowship, Diane P. og Robert E. Sharp Fund og National Science Foundation's Plant Genome Research Program (IOS-1546873) til PM. CDTC, CMRV, EDCDP og RJRR støttes af Ateneo College Scholarship Program. CDTC, EDCDP og RJRR understøttes af DOST-SEI S&T Undergraduate Scholarship. DODL støttes af Fr. Thomas Steinbugler SJ Academic Scholarship. RJRR understøttes af Aiducation International - Pathways to Higher Education Scholarship. Dette arbejde blev støttet af School of Science and Engineering og Rizal Library, Ateneo de Manila University.

Forbedrede metoder til billeddannelse af majsblad-Primordia

Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.

Vi præsenterer to metoder til fremstilling af majsbladprimordia til cellulær billeddannelse. Den første metode (protokolafsnit 2) tillader måling af primordium til tværsnitsanalyse, mens den anden metode (protokolafsnit 3) muliggør udrullning og udfladning af primordium til helmonteret analyse. Disse metoder letter cellulær billeddannelse af FP'er i majsbladprimordia24 (som vist i figur 4 og figur 5) og giver enkle løsninger på udfordringerne ved billeddannelse af majsblade. Protokolafsnit 2 reducerer dissektionstiden og forbedrer prøveudtagningsnøjagtigheden ved at måle primordierne før sektionering i stedet for udelukkende at stole på iscenesættelsesparametre 9,16. Med kommercielt tilgængelig nanotape løser protokolafsnit 3 det mangeårige problem med billeddannelse af helbladet primordia i majs. Denne protokol forbedrer den tidligere metode, der brugte dialyserør 31, og er et meget billigere alternativ til CT og MR11,32,33. Men når det kommer til at visualisere bladanatomiske træk og producere optimale resultater, har begge protokoller nogle begrænsninger, som er skitseret i tabel 2 og diskuteres mere detaljeret nedenfor.
I protokolafsnit 2 stødte vi på vanskeligheder med at visualisere cellekonturer i tykke tværsnit af bladprimordia, og modfarvning med cellevægs- eller plasmamembranbindende fluorescerende farvestoffer gav ikke tilfredsstillende resultater. For eksempel gav FM 4-64 suboptimale resultater sammenlignet med plasmamembranens FP-markør, p Zm PIP2-1::ZmPIP2-1:CFP39 (PIP2-1-CFP; Figur 3A-D). For at overvinde denne begrænsning anbefaler vi at bruge et vibratomt til at producere tyndere vævssektioner (~ 0,1 mm)58, hvilket giver mulighed for en levende lysfeltbilleddannelse af cellekonturer eller optimering af modfarvningsprotokollen 47,59.
I protokolafsnit 3 er hovedbegrænsningen vanskeligheden ved at montere bladet uden at rive, beskadige eller luftbobler, som beskrevet i protokoltrin 3.2.5-3.2.6 (figur 3E-K). Da majsbladet er bilateralt symmetrisk, kan et halvbladsbeslag snarere end et helbladsbeslag være tilstrækkeligt til visualisering9. For at gøre dette kan primordium skæres med et barberblad langs længdeaksen efter udrullning op til midrib, så kun halvdelen af bladet kan monteres. En anden begrænsning i protokolafsnit 3 er, at bladets tykkelse kan begrænse fluoroforsignalets optiske opløsning under dyb billeddannelse. For at løse dette problem er det muligt at anvende en vævsrensningsteknik60. Vi fandt imidlertid, at ClearSee61, et almindeligt anvendt clearingreagens til billeddannelse af plantevæv, ikke er kompatibelt med protokollen, fordi det får prøven og dækslet til at løsne sig fra nanobåndet. En mulig løsning på dette problem kunne være at påføre en semipermeabel membran31 over bladprøven, så den kan behandles med clearingopløsningen, mens den holdes på plads af nanobåndet. En sådan metode, der gør det muligt at anvende flydende opløsninger på det uvalsede blad, kunne også anvendes til helmonteret RNA in situ-hybridisering og immunlokaliseringsteknikker, som tidligere er optimeret til udvikling af majsblomsterstande, men ikke til helbladet primordia62,63.
Vi beskrev protokoller for majs, som har store blade primordia selv på frøplantestadiet. Andre græsarter med meget mindre blade primordia, såsom ris, byg, hvede, Setaria og Brachypodium 16,23,64,65,66, kan kræve brug af yderligere præcisionsværktøjer for effektivt at anvende disse protokoller. Desuden var disse protokoller ikke beregnet til levende cellebilleddannelse, som fanger dynamiske processer i realtid med vævsdannelse og cellulære reaktioner. Men efterhånden som fluorescerende sonder, billeddannelsesteknologier og computerkapacitet fortsætter med at udvikle sig inden for levende cellebilleddannelse til planter67, kan fremtidig forskning bygge videre på disse protokoller for at udvikle levende cellebilleddannelsesstrategier, der er skræddersyet til de unikke egenskaber ved græsbladprimordia.

Græsafgrøder er en vigtig kilde til mad og biobrændstof til den globale befolkning1, og forbedring af bladanatomi har potentialet til at øge deres produktivitet 2,3. Vores nuværende forståelse af, hvordan bladanatomi reguleres i græsser, er imidlertid begrænset4 og kræver analyse af bladprimordia, da mange anatomiske og fysiologiske træk ved bladet er forudbestemt tidligt i udviklingen 5,6,7. Cellulære billeddannelsesteknikker, såsom fluorescens og konfokal billeddannelse, er uundværlige for at studere græsbladanatomi og cellulære træk, men disse teknikker er vanskelige at anvende på græsbladprimordia, fordi de er dybt beklædt og rullet i bladhvirvlen. Vi løste dette problem ved at udvikle metoder til forberedelse af tværsnit og udrullede helbladsmonteringer til fluorescens og konfokal analyse af majsbladprimordia, et modelsystem til undersøgelse af græsbladanatomi og udvikling 2,8.
Majsbladet består som alle græsblade af et remlignende blad med en kappe, der vikles rundt om stilken og udvikler skud 9,10,11,12,13. Bladene udvikler sig fra skuddet apikale meristem (SAM) i et distichous mønster, hvor hvert nyt blad starter i den modsatte position af det foregående blad, hvilket resulterer i to rækker blade langs den lodrette akse (figur 1A)14 . Udviklingsstadiet for hvert bladprimordium identificeres ved dets position i forhold til SAM, med det nærmeste primordium betegnet som plastochron1 (P1) og de følgende primordier betegnet som P2, P3 osv. (figur 1B, C)2. Under udviklingen (figur 1D) fremstår bladprimordiet først som en halvmåneformet støttepille omkring bunden af SAM (P1) og vokser derefter til et hætteformet primordium, der strækker sig over meristemet (P2)9,10,11. Emhættens basale margener udvider sig derefter sideværts og overlapper hinanden, når spidsen vokser opad og danner et kegleformet primordium (P3-P5)10. Primordiet vokser derefter hurtigt i længden, og kappe-bladgrænsen ved bunden bliver mere fremtrædende med dannelsen af ligule, den frynselignende fremspring på bladets adaxiale side (P6/P7). Endelig ruller bladet ud, når det kommer ud af hvirvlen under steady-state vækst, hvor de delende celler er begrænset inden for bladets lille basale område og danner en gradient med ekspanderende og differentierende celler langs den proksimale-distale akse (P7 / P8)15. Skudspidsen af en majsplante indeholder flere primordia på forskellige udviklingsstadier, hvilket gør den til en fremragende model til at studere bladudvikling8.
Nøjagtig analyse af tidlig bladudvikling kræver iscenesættelse eller brug af standardiserede kriterier til at definere forskellige stadier af primordiumudvikling i forhold til andre vækst- eller morfologiske parametre. Fordi bladprimordierne er skjult i græsskuddet, bruger efterforskere typisk parametre som plantens alder eller størrelsen af de nye blade som forudsigere for stadierne og størrelserne af bladet primordia 9,16. I majs bestemmes plantens kronologiske alder enten af antallet af dage efter plantning eller spiring (DAP/DAG)17,18. Det vegetative stadium (V-trin) bestemmes af det øverste blad med en synlig krave, en lys linje på den abaxiale side mellem bladet og kappen, der svarer til positionen af ligule og aurikler, et par kileformede regioner ved bunden af bladet (figur 1A, B) 17,19 . Mellem 20 og 25 DAG overgår SAM til et blomsterstandmeristem og ophører med at producere nye blade20. Vækstraterne for majsbladprimordia kan variere afhængigt af miljøet og plantens genotype. Af denne grund kan plantens alder og størrelsen af de nye blade ikke nøjagtigt forudsige størrelsen af bladprimordia; Brug af disse parametre kan dog hjælpe med at forudsige rækkevidden af Primordia-stadier og -størrelser til eksperimentelle formål.
Tværsnitsanalyse er en populær metode til undersøgelse af bladanatomi og udvikling i majs og andre græsser, fordi det giver mulighed for prøveudtagning af flere plastokroner i en enkelt sektion på tværs af skuddet21,22,23. Denne metode er også praktisk til cellulær billeddannelse af friske prøver, da de omgivende blade fungerer som et stillads, der holder bladets primordia på plads under sektionering og montering24. En ulempe ved denne metode er imidlertid, at det kan være udfordrende præcist at lokalisere målplastochronen og regionen inden for primordium, når man sektionerer fra et intakt skud. Da bladvæksten varierer på tværs af plastokroner og langs den proksimale-distale akse2,5, kan upræcis prøveudtagning resultere i en forkert fortolkning af primordiumets udviklingsstadium og region i et givet afsnit. Derfor er udvikling af en metode til præcis tværsnitsprøvetagning afgørende for at sikre nøjagtigheden og reproducerbarheden af anatomiske og udviklingsmæssige analyser af græsbladprimordia.
Helbladsmonteringsanalyse muliggør omfattende og integrativ undersøgelse af vævs- og cellulære processer, der forekommer på helorganskala, såsom proliferativ vækst25 og venemønster26,27,28. Metoden giver et paradermalt overblik over bladet, hvilket gør det muligt at opdage forskellige processer og mønstre, der ellers ville være vanskelige at opdage ved hjælp af tværsnitsanalyse24,27. I modsætning til i Arabidopsis, hvor der allerede findes etablerede metoder til billeddannelse af helbladsmonteringer29,30, findes der i øjeblikket ingen standardmetode til billeddannelse af rullet helbladsmontering i græsser. En tidligere protokol for udrullning af isolerede majsblade primordia involverede usædvanlige materialer og var ikke egnet til cellulær billeddannelse31. Avancerede billeddannelsesteknikker, såsom computertomografi (CT) og magnetisk resonansbilleddannelse (MR), kan erhverve 3D anatomisk information uden at isolere og udrulle primordia 11,32,33, men de er dyre og kræver specialudstyr. Udvikling af en teknik til at overvinde de begrænsninger, der er pålagt af den valsede og koniske morfologi af bladprimordia i majs og andre græsser, ville fremme undersøgelser af deres anatomiske og udviklingsmæssige træk.
Her præsenterer vi metoder til forberedelse af tværsnit og udrullede hele monteringer af majsbladprimordier til fluorescens og konfokal billeddannelse. Vi brugte disse metoder til at kvantificere veneantal og kortlægge den rumlige-temporale hormonfordeling i majsbladprimordia med fluorescerende proteiner (FP'er)24. Den første metode går ud på at fjerne den øverste del af ældre blade fra majsplanter med en trådfjerner (figur 1E). Ved at eksponere spidsen af primordium (P5-P7) bliver det muligt at bestemme dens længde uden helt at skulle fjerne de ældre omgivende blade, hvilket muliggør nem og præcis sektionering. Den anden metode involverer udrulning og montering af helbladet primordia (P3-P7) med klar, dobbeltsidet nanotape (figur 1F). Disse metoder er egnede til visualisering af forskellige FP'er24, men har brug for optimering til brug af fluorescerende farvestoffer og rydningsreagenser. Derudover skitserer vi nogle procedurer for samkopiering af z-stakke, syning af billeder og sammenlægning af kanaler i ImageJ/FIJI34, som gælder for de billeder, der produceres ved hjælp af de to metoder. Disse metoder er nyttige til rutinemæssig fluorescens eller konfokal billeddannelse af majsblade, men de kan også tilpasses til andre modelgræsarter, såsom ris, Setaria og Brachypodium.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig01.jpg"> Figur 1: Organisation og morfologi af majsbladprimordia og oversigt over metoderne. A) Skematisk gengivelse af en majsplante. Majs har en distichous phyllotaxy, hvor det nye blad starter i den modsatte position af det forrige blad. Bladnummeret angiver den kronologiske rækkefølge, hvori bladene opstod ved spiring (dvs. første blad, L1; andet blad, L2; tredje blad, L3 osv.). Hvert blad har et distalt blad og en basalkappe afgrænset af en krave, der svarer til ligule og auricle. Det øverste blad med kraven synlig angiver det vegetative stadium. Frøplanten i dette eksempel er på V2-stadiet, med L2-kraven (pilespids) synlig. Saksikonet angiver placeringen ved mesocotyl (mig), hvor frøplanten skal skæres for at blive indsamlet. (B) Skematisk gengivelse af det dissekerede skud, der viser isoleret L1 til L4, med bladet primordia L5 til L9 vist som et forstørret billede i (C). Plastochrontallet angiver primordiumets position i forhold til SAM, med det yngste bladprimordium (P1) tættest på SAM og det ældre bladprimordia (P2, P3, P4 osv.) successivt længere væk2. D) Skematisk gengivelse af morfologien af majsbladprimordia fra P1 til P5. E) Skematisk oversigt over metoden til tværsnitsanalyse af majsbladets primordia. (1) Trim de ældre blade med en trådfjerner. (2) Mål primordium og snit skuddet. (3) Monter sektionen på et dias til billeddannelse og behandling (4, 5). F) Skematisk oversigt over metoden til helmonteringsanalyse af majsbladets primordia. (1) Fjern de omgivende blade for at ekstrahere primordium. (2) Klip og rul primordium fladt ud på nanobåndet. (3) Monter prøven til billeddannelse og behandling (4, 5). Forkortelser: L = blad; bl = blad; sh = kappe; co = krave; mig = mesocotyl; V = vegetativ; P = plastochron; SAM = skyd apikal meristem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylic Gel Clear Double Sided Nano Tape 16.5 ft x 1.2 in, 2 mm thick</td>
			<td>EZlifego Store (Amazon)</td>
			<td>B07YB1ZXG6</td>
			<td>1 roll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bellucci Pick Curved micro probe 16.8 cm, 6.6 in</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>N1692 9</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clayman guide microprobe Sinskey hook angled shaft, 11.6 cm, 4.6 in</td>
			<td>Storz Opthalmic Instruments</td>
			<td>E0542</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Probe, Bent Needle, 14 cm (5.5 in)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>13553</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWELL 10-22 AWG Wire Stripper</td>
			<td>Dowell Store (Amazon)</td>
			<td>10-22 AWG</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Double Edge Carbon Steel Blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-9</td>
			<td>pkg/10; for fine sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted End Glass Microscope Slides, 75 mm x 25 mm x 1-1.2 mm</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260442</td>
			<td>pkg/144</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEM Single Edge, Stainless Steel Uncoated Blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-1</td>
			<td>box/200; for general cutting/sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI17904</td>
			<td>1 liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FIJI with EDF plugin (version 17.05.2021) and Grid/Collection Stitching plugin</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH) USA</td>
			<td>version 2.9.0/1.54s</td>
			<td>The EDF plugin was developed by Alex Prudencio, Jesse Berent, and Daniel Sage for the Biomedical Imaging Group, &#201;cole Polytechnique F&#233;d&#233;rale de Lausanne (EPFL; http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/). The grid/collection stitching software was developed by Stephan Preibisch for the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Ex-L Small 111.76 mm x 213.36 mm</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>34155</td>
			<td>box/280 ply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, 22 mm x 22 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260140</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PU Gel Clear Double Sided Nano Tape 29.5 ft x 1.18 in, 1 mm thick</td>
			<td>Yecaye Store (Amazon)</td>
			<td>L354 W1.18</td>
			<td>2 rolls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superslip Cover Glasses, 24 mm x 50 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260166</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superslip Cover Glasses, 24 mm x 60 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260168</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempered Glass Cutting Board</td>
			<td>Hacaroa (Amazon)</td>
			<td>B09XMXBT5S</td>
			<td>4 pc</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging

I majs (Zea mays) og andre græsser (Poaceae) er bladprimordierne dybt beklædt og rullet i bladhvirvlen, hvilket gør det vanskeligt at studere tidlig bladudvikling. Her beskriver vi metoder til forberedelse af tværsnit og udrullede hele monteringer af majsbladprimordia til fluorescens og konfokal billeddannelse. Den første metode bruger en trådfjerner til at fjerne de øverste dele af ældre blade, udsætte spidsen af bladprimordium og tillade dens måling for mere nøjagtig tværsnitsprøveudtagning. Den anden metode bruger klar, dobbeltsidet nanotape til at rulle ud og montere helbladet primordia til billeddannelse. Vi viser nytten af de to metoder til at visualisere og analysere fluorescerende proteinreportere i majs. Disse metoder giver en løsning på udfordringerne ved den karakteristiske morfologi af majsbladprimordia og vil være nyttige til at visualisere og kvantificere bladanatomiske og udviklingsmæssige træk i majs og andre græsarter.

Grass crops are a major source of food and biofuel for the global population1, and improving leaf anatomy has the potential to increase their productivity2,3. However, our current understanding of how leaf anatomy is regulated in grasses is limited4 and requires the analysis of leaf primordia, as many anatomical and physiological traits of the leaf are predetermined early in development5,6,7. Cellular imaging techniques, such as fluorescence and confocal imaging, are indispensable for studying grass leaf anatomy and cellular traits, but these techniques are difficult to apply to grass leaf primordia because they are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl. We addressed this issue by developing methods for preparing transverse sections and unrolled whole-leaf mounts for fluorescence and confocal analysis of maize leaf primordia, a model system for studying grass leaf anatomy and development2,8.
The maize leaf, like all grass leaves, consists of a strap-like blade with a sheath that wraps around the stem and developing shoot9,10,11,12,13. The leaves develop from the shoot apical meristem (SAM) in a distichous pattern, where each new leaf initiates in the opposite position of the previous leaf, resulting in two ranks of leaves along the vertical axis&#160;(Figure 1A)14 . The developmental stage of each leaf primordium is identified by its position relative to the SAM, with the closest primordium designated as plastochron1 (P1) and the following primordia designated as P2, P3, and so on (Figure 1B,C)2. During development (Figure 1D), the leaf primordium first appears as a crescent-shaped buttress around the base of the SAM (P1), and then grows into a hood-shaped primordium that extends over the meristem (P2)9,10,11. The basal margins of the hood then expand laterally and overlap each other as the tip grows upward, forming a cone-shaped primordium (P3-P5)10. The primordium then rapidly grows in length, and the sheath-blade boundary at the base becomes more prominent with the formation of the ligule, the fringe-like projection on the adaxial side of the leaf (P6/P7). Finally, the leaf unrolls as it emerges from the whorl during steady-state growth, in which the dividing cells are restricted within the small basal region of the blade, forming a gradient with expanding and differentiating cells along the proximal-distal axis (P7/P8)15. The shoot apex of a maize seedling contains multiple primordia at different stages of development, making it an excellent model for studying leaf development8.
Accurate analysis of early leaf development requires staging or the use of standardized criteria to define distinct stages of primordium development in relation to other growth or morphological parameters. Because the leaf primordia are hidden within the grass shoot, investigators typically use parameters such as the age of the plant or the size of the emerging leaves as predictors for the stages and sizes of the leaf primordia9,16. In maize, the chronological age of the plant is determined either by the number of days after planting or germination (DAP/DAG)17,18. The vegetative stage (V stage) is determined by the uppermost leaf with a visible collar, a pale line on the abaxial side between the blade and the sheath that corresponds to the position of the ligule and auricles, a pair of wedge-shaped regions at the base of the blade&#160;(Figure 1A,B)17,19 . Between 20 and 25 DAG, the SAM transitions into an inflorescence meristem and ceases to produce new leaves20. The growth rates of maize leaf primordia can vary depending on the environment and the genotype of the plant. For this reason, plant age and the size of the emerging leaves cannot accurately predict the sizes of leaf primordia; however, using these parameters can help predict the range of primordia stages and sizes for experimental purposes.
Transverse section analysis is a popular method for examining leaf anatomy and development in maize and other grasses because it allows for the sampling of multiple plastochrons in a single section across the shoot21,22,23. This method is also convenient for cellular imaging of fresh samples, as the surrounding leaves serve as a scaffold&#160;that keeps the leaf primordia in place during sectioning and mounting24. However, a disadvantage of this method is that it can be challenging to precisely locate the target plastochron and region within the primordium when sectioning from an intact shoot. Furthermore, because leaf growth varies across plastochrons and along the proximal-distal axis2,5, imprecise sampling could result in an incorrect interpretation of the developmental stage and region of the primordium in a given section. Therefore, developing a method for precise transverse section sampling is critical for ensuring the accuracy and reproducibility of anatomical and developmental analyses of grass leaf primordia.
Whole-leaf mount analysis enables the comprehensive and integrative investigation of tissue and cellular processes that occur at the whole-organ scale, such as proliferative growth25 and vein patterning26,27,28. The method provides a paradermal overview of the leaf, allowing the discovery of distinct processes and patterns that would otherwise be difficult to detect using transverse section analysis24,27. Unlike in Arabidopsis, where there are already established methods for imaging whole-leaf mounts29,30, there is currently no standard method for imaging unrolled whole-leaf mounts in grasses. A previous protocol for unrolling isolated maize leaf primordia involved uncommon materials and was not suitable for cellular imaging31. Advanced imaging techniques, such as computed tomography (CT) and magnetic resonance imaging (MRI), can acquire 3D anatomical information without isolating and unrolling the primordia11,32,33, but they are expensive and require specialized equipment. Developing a technique to overcome the constraints imposed by the rolled and conical morphology of leaf primordia in maize and other grasses would advance investigations into their anatomical and developmental traits.
Here, we present methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging. We used these methods to quantify vein number and map the spatial-temporal hormone distribution in maize leaf primordia with fluorescent proteins (FPs)24. The first method involves removing the upper portion of older leaves from maize seedlings with a wire stripper (Figure 1E). By exposing the tip of the primordium (P5-P7), it becomes possible to determine its length without having to completely remove the older surrounding leaves, thus enabling easy and accurate sectioning. The second method involves unrolling and mounting whole-leaf primordia (P3-P7) with clear, double-sided nano tape (Figure 1F). These methods are suitable for visualizing various FPs24&#160;but need optimization for using fluorescent dyes and clearing reagents. In addition, we outline some procedures for flattening z-stacks, stitching images, and merging channels in ImageJ/FIJI34, which apply to the images produced by the two methods. These methods are useful for routine fluorescence or confocal imaging of maize leaves, but they can also be adapted for other model grass species, such as rice, Setaria, and Brachypodium.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig01.jpg" /> 
Figure 1: Organization and morphology of maize leaf primordia and overview of the methods. (A) Schematic representation of a maize seedling. Maize has a distichous phyllotaxy, with the new leaf initiating at the opposite position of the previous leaf. The leaf number indicates the chronological order in which the leaves emerged from germination (i.e., first leaf, L1; second leaf, L2; third leaf, L3; etc.). Each leaf has a distal blade and a basal sheath delineated by a collar that corresponds to the ligule and auricle. The uppermost leaf with the collar visible denotes the vegetative stage. The seedling in this example is at the V2 stage, with the L2 collar (arrowhead) visible. The scissors icon indicates the location at the mesocotyl (me) where the seedling must be cut in order to be collected. (B) Schematic representation of the dissected shoot showing isolated L1 to L4, with the leaf primordia L5 to L9 shown as an enlarged image in (C). The plastochron number indicates the position of the primordium relative to the SAM, with the youngest leaf primordium (P1) closest to the SAM and the older leaf primordia (P2, P3, P4, and so on) successively farther away2. (D) Schematic representation of the morphology of maize leaf primordia from P1 to P5. (E) Schematic overview of the method for transverse section analysis of the maize leaf primordia. (1) Trim the older leaves with a wire stripper. (2) Measure the primordium and section the shoot. (3) Mount the section on a slide for imaging and processing (4, 5). (F) Schematic overview of the method for whole-mount analysis of the maize leaf primordia. (1) Remove the surrounding leaves to extract the primordium. (2) Cut and unroll the primordium flat on the nano tape. (3) Mount the sample for imaging and processing (4, 5). Abbreviations: L = leaf; bl = blade; sh = sheath; co = collar; me = mesocotyl; V = vegetative; P = plastochron; SAM = shoot apical meristem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Forfatter Spotlight: Forbedrede metoder til forberedelse af tværgående sektioner og udrullede hele monteringer af majsbladsprimmordia til fluorescens og konfokal billeddannelse  

Forbedrede metoder til forberedelse af tværsnit og valsede hele monteringer af majsbladprimordia til fluorescens og konfokal billeddannelse

Grasses like maize have leaf primordia grow within the shoot, making them difficult to study. We address this problem with improved protocols for preparing maize leaf transverse sections and whole mounts for fluorescence and confocal imaging. The first protocol uses a wire stripper to cut the older leaves, allowing the measurement of the primordium prior to sectioning.The second protocol uses clear, double-sided nano tape to unroll whole leaf primordium. These protocols improve the accuracy of transverse sectioning and enable unrolling of the leaf primordia, which have been very difficult to achieve due to their rolled, conical morphology. These methods will be useful for visualizing and quantifying leaf anatomical and developmental traits in maize and other grasses.Based on these methods, we plan to develop live cell imaging strategies to address questions in grass leaf development.

Tværsnitsanalyse af majsbladprimordia Vi brugte protokolafsnit 2 til at kvantificere veneantal og karakterisere hormonresponsmønstre i tværgående sektioner af majsbladprimordier med FP'er (figur 4)24. For at vurdere plantehormonet auxins rolle i bladvækst og venedannelse kvantificerede vi antallet af vener i bladprimordien hos en majsmutant med auxinmangel, forsvindende kvast254. I tidlige plastokroner udviser udviklende vener tydelig cellularisering i mediancellelaget i majsbladets primordium21,22. Imidlertid kan identifikation og tælling af vener ved hjælp af konventionelle histologiske teknikker22 være arbejdskrævende og tidskrævende. For at kvantificere venerne brugte vi således majsauxin-effluxproteinmarkøren p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP41 (PIN1a-YFP i det følgende), som markerer udvikling af vener og procambiale tråde (PCS'er; Figur 4A). Ved hjælp af protokolafsnit 2 var vi i stand til at standardisere tværsnitsprøvetagningen ved at måle primordia før sektionering (figur 4B, C). Vi opdagede en tendens, hvor vt2 har et bredere primordium og flere vener end normalt (figur 4D,E)24, hvilket er i overensstemmelse med data fra fuldt udvidede blade55, hvilket indikerer, at defekten i vt2 begyndte tidligt i bladudviklingen. Ved hjælp af protokolafsnit 2 var vi også i stand til systematisk at undersøge ekspressionsmønstrene for hormonrespons FP-reportere i bladprimordierne (se eksempler på billederne i figur 4F-I). Gennem et standardiseret prøveudtagningsskema med tværsnit kortlagde vi fordelingen af auxin-, cytokinin- (CK) og gibberellinsyreresponser (GA) på tværs af forskellige plastokroner og regioner i bladprimordia og opdagede nye responsmønstre, som vi antager har konsekvenser for bladvækst og venedannelse24. Disse repræsentative resultater viser derfor nytten af protokolafsnit 2 til tværsnitsanalyse af majsbladprimordia.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig04.jpg"> Figur 4: Repræsentative resultater for tværsnitsanalyse af majsbladprimordia. (A-E) Kvantificering af veneantal og primordiumbredde i bladprimordia af normal og forsvindende kvast2 med auxineffluxproteinmarkøren PIN1a-YFP. (A) Repræsentative fluorescensbilleder af tværsnit af P5 til P7, der udtrykker PIN1a-YFP i udviklingsvener og procambiale tråde. De tværgående sektioner blev afbildet med et epifluorescensmikroskop ved hjælp af et FITC-filter (495-519 nm excitation). Antallet af vener og primordiumbredden blev kvantificeret ved hjælp af flerpunkts- og frihåndslinjeværktøjerne i henholdsvis FIJI/ImageJ. B) Majsplante med de øverste bladhvirvler fjernet med en trådstripper for at blotlægge spidsen af det fjerde blad (L4). Beslaget spænder over den projicerede primordiumlængde, hvor den stiplede linje angiver midterlængden. (C) Skematisk diagram over varierende primordiumformer fra P5 til P7, der illustrerer, hvordan veneantal og primordiumbredde i midten (vandret stiplet linje) kan variere afhængigt af primordiumets udviklingsstadium. (D,E) Måling af primordiumbredde (D) og venetal (E) i midtersektionen af L4 af normal og vt2. Trendlinjen repræsenterer 10 mm rullende gennemsnit af målinger ± standardfejl for middelværdien (SEM). (F-I) Repræsentative konfokale billeder af tværgående sektioner af bladprimordia, der udtrykker kombinationer af PIN1a-YFP, auxin response reporter, DR5-RFP, cytokinin response reporter, TCS-tomat, gibberellinsyre-responsiv markør, GAR2-YFP og mDII-Venus, en muteret version af auxinsignalindgangsreporteren DII-Venus. FP-kanalerne er overlejret på lysfeltkanalen i hvert billede. Skalabjælke = 200 μm (A); 10 mm (B); 100 μm (F-I). Denne figur er blevet ændret og gengivet med tilladelse fra Robil og McSteen24. Forkortelser: DAG = dage efter spiring; P = plastochron; VT2 = forsvindende kvast2; PCS = procambial streng; YFP = gult fluorescerende protein; FITC = fluoresceinisothiocyanat; RFP = rødt fluorescerende protein; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; TCS-Tomat = TCSv2:: NLS-tdTomat; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; mDII-Venus = pZmUbi:mDII:YFP-NLS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Helmonteringsanalyse af majsbladprimordia Vi fulgte protokollens afsnit 3 for at visualisere og analysere FP-ekspression i helbladsmonteringer af majsbladprimordia (figur 5). Ved at visualisere venemønstre med PIN1a-YFP fandt vi, at dannelsen af vener forekommer i hele primordium under tidlige plastokroner, men denne proces bliver begrænset i de proksimale regioner senere i udviklingen (figur 5A)24. Som supplement til tværsnitsanalyserne har helbladsmonteringsanalyserne afsløret vævs- og fasespecifikke mønstre for hormonrespons under venedannelse24. Et eksempel er udtryksmønsteret for CK-responsreporteren TCSv2::NLS-tdTomato37 (TCS-Tomat) i forhold til PIN1a-YFP-udtryk (figur 5B)24. Ved at følge protokolafsnit 3 var vi i stand til at udføre både kvalitative og kvantitative analyser af FP-ekspression i bladets primordia (figur 5D-F; upublicerede data). Vi undersøgte ekspressionsmønstrene for en auxin-responsreporter, DR5rev::mRFPer41 (DR5-RFP), og en GA-responsiv markør, p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP39 (GAR2-YFP), i helbladsmonteringer af enkelt- ogdobbeltmutanter af vt2 og dværgplante3 (d3), en GA-mangelfuld mutant56 (figur 5D). Vi sammenlignede også de relative niveauer af celleproliferation mellem normal og vt2 bladprimordia ved hjælp af p Zm Cyclin-D2B::ZmCyclin-D2B:YFP42 (Cyclin-D2B-YFP), som er en markør for G1/S-overgangen i cellecyklussen57 (figur 5E,F). Selvom der ikke var nogen signifikant forskel mellem normal og vt2, var Cyclin-D2B-YFP-ekspression i overensstemmelse med den kendte celleproliferationsprofil for tidlige plastochroner31. Vi konkluderer, at protokolafsnit 3 er en effektiv metode til analyse af hele monteringer af majsbladprimordia, som er vanskelige at afbilde på grund af deres rullede morfologi.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig05.jpg"> Figur 5: Repræsentative resultater for helmonteret analyse af majsbladprimordia. (A) Repræsentative fluorescensbilleder af bladprimordia af 7 DAG-majsfrøplanter, der viser årer under udvikling og procambiale tråde, som markeret med auxin-effluxproteinmarkøren PIN1a-YFP. P3-P6 primordia blev udskåret fra basen, rullet ud og fladtrykt med den adaxiale side opad. Indsatser viser nærbilleder af P3 og P4. I P5 og P6 afgrænser stiplede linjer den distale ende af de proliferative zoner, hvor størstedelen af procambiale tråde stadig udvikler sig og strækker sig. (B,C) Repræsentative konfokale billeder, der viser ekspressionen af PIN1a-YFP og cytokininresponsreporter, TCS-tomat, i det proksimale marginalområde af et P5-primordium. (D) Repræsentative fluorescensbilleder af P4 primordia, der viser ekspressionen af auxin response reporter, DR5-RFP, og gibberellinsyre-responsiv markør, GAR2-YFP i normale og enkelt- og dobbeltmutanter af forsvindende kvast2 og dværgplante3. (E) Repræsentative konfokale billeder af P3 og/eller P4, der viser ekspressionen af Cyclin-D2B-YFP, en reporter for G1/S-overgangen i cellecyklussen. (F) Relative mængder af celleproliferation i P3/P4 bladprimordia af normal og vt2, kvantificeret ved at måle den integrerede tæthed af Cyclin-D2B-YFP-signalet over primordiumområdet ved hjælp af ImageJ/FIJI. Søjlerne repræsenterer middelværdierne ± standardfejlen i middelværdien. Skalabjælke = 500 μm (A, D, E); 200 μm (B); 100 μm (C). Figur 4A-C er blevet ændret og gengivet med tilladelse fra Robil og McSteen24, mens figur 4D-F er upublicerede data fra forfatterne. Forkortelser: DAG = dage efter spiring; P = plastochron; VT2 = forsvindende kvast2; d3 = dværgplante3; YFP = gult fluorescerende protein; RFP = rødt fluorescerende protein; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; TCS-Tomat = TCSv2:: NLS-tdTomat; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; Cyclin-D2B-YFP = p Zm Cyclin-D2B::ZmCyclin-D2B: YFP; ns = ingen signifikant forskel au = vilkårlig enhed. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Supplerende fil 1: Eksempler på iscenesættelse af bladudvikling i majsplanter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239_S_File_1_Leaf_staging_maize_seedling_Fall2019%20(1).xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende figur S1: Planteprøver og materialer, der anvendes i protokollerne. (A,B) En majsplante 7-8 DAG med den øverste bladhvirvel fjernet ved hjælp af en trådstripper. (B) Indsatsen viser et nærbillede af optagelsen med det eksponerede P6 primordium. (C-G) Skud af majsplanter med de øverste hvirvler fjernet med henblik på tværsnitsanalyse (C,D) og omgivende blade helt fjernet med henblik på helmonteringsanalyse (E-G). (H) En rulle polyurethangel klar dobbeltsidet nanotape. (I,J) P6 bladprimordium (I) og proksimal region af P8 blad (J) rullet ud og monteret på glasglas med nanobåndet. K) Et glasglas med et urullet bladprimordium monteret på et epifluorescensmikroskop. Forkortelse: DAG = dage efter spiring. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/S_FIGURE_1.pdf" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging at JoVE.com

Majsbladprimordia er dybt beklædt og rullet, hvilket gør dem vanskelige at studere. Her præsenterer vi metoder til forberedelse af tværsnit og udrullede hele monteringer af majsbladprimordier til fluorescens og konfokal billeddannelse.

In maize (Zea mays) and other grasses (Poaceae), the leaf primordia are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl, making it difficult to study ...

Græsser som majs har bladprimordia vokser inden for skuddet, hvilket gør dem vanskelige at studere. Vi løser dette problem med forbedrede protokoller til forberedelse af majsbladtværsnit og hele monteringer til fluorescens og konfokal billeddannelse. Den første protokol bruger en trådstripper til at skære de ældre blade, hvilket muliggør måling af primordium inden sektionering.Den anden protokol bruger klar, dobbeltsidet nanotape til at rulle hele bladet primordium ud. Disse protokoller forbedrer nøjagtigheden af tværsnit og muliggør udrulning af bladets primordia, hvilket har været meget vanskeligt at opnå på grund af deres rullede, koniske morfologi. Disse metoder vil være nyttige til visualisering og kvantificering af bladanatomiske og udviklingsmæssige træk i majs og andre græsser.Baseret på disse metoder planlægger vi at udvikle levende cellebilleddannelsesstrategier til at løse spørgsmål inden for græsbladudvikling.

Forbedrede metoder til forberedelse af tværsnit og valsede hele monteringer af majsbladprimordia til fluorescens og konfokal billeddannelse

Abstract