De auteurs willen graag de Maize Genetics Cooperation, het Maize Cell Genomics Project, Dave Jackson (Cold Spring Harbor Laboratory, NY), Anne W. Sylvester (Marine Biological Laboratory, University of Chicago, IL), Andrea Gallavotti (Rutgers University, NJ) en Carolyn G. Rasmussen (University of California, Riverside) bedanken voor het leveren van de mutante en transgene bestanden, evenals Robert F. Baker en Alexander Jurkevich van de Advanced Light Microscopy Core aan de University of Missouri-Columbia voor hun hulp bij confocale microscopie. JMR werd ondersteund door de J. William Fulbright Fellowship, The Diane P. and Robert E. Sharp Fund en het Plant Genome Research Program (IOS-1546873) van de National Science Foundation tot PM. CDTC, CMRV, EDCDP en RJRR worden ondersteund door het Ateneo College Scholarship Program. CDTC, EDCDP en RJRR worden ondersteund door de DOST-SEI S&T Undergraduate Scholarship. DODL wordt ondersteund door Fr. Thomas Steinbugler SJ Academic Scholarship. RJRR wordt ondersteund door Aiducation International-Pathways to Higher Education Scholarship. Dit werk werd ondersteund door de School of Science and Engineering en de Rizal Library, Ateneo de Manila University.

Verbeterde methoden voor het afbeelden van maïsblad Primordia

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

We presenteren twee methoden voor het bereiden van maïsblad primordia voor cellulaire beeldvorming. De eerste methode (protocolsectie 2) maakt het mogelijk het primordium te meten voor transversale sectieanalyse, terwijl de tweede methode (protocolsectie 3) het uitrollen en afvlakken van het primordium mogelijk maakt voor analyse van de gehele mount. Deze methoden vergemakkelijken de cellulaire beeldvorming van FP's in maïsblad primordia24 (zoals weergegeven in figuur 4 en figuur 5) en bieden eenvoudige oplossingen voor de uitdagingen van het in beeld brengen van ontwikkelende maïsbladeren. Protocol sectie 2 vermindert de dissectietijd en verbetert de bemonsteringsnauwkeurigheid door de primordia voorafgaand aan de sectie te meten in plaats van alleen te vertrouwen op stadiëringsparameters 9,16. Met in de handel verkrijgbare nanotape lost protocolsectie 3 het al lang bestaande probleem op van het in beeld brengen van primordia van hele bladeren in maïs. Dit protocol verbetert de vorige methode, die dialysebuizen31 gebruikte, en is een veel goedkoper alternatief voor CT en MRI 11,32,33. Als het echter gaat om het visualiseren van anatomische eigenschappen van bladeren en het produceren van optimale resultaten, hebben beide protocollen enkele beperkingen, die worden beschreven in tabel 2 en hieronder in meer detail worden besproken.
In protocolsectie 2 ondervonden we problemen met het visualiseren van celcontouren in dikke dwarsdoorsneden van de bladprimordia, en tegenkleuring met celwand- of plasmamembraanbindende fluorescerende kleurstoffen leverde geen bevredigende resultaten op. FM 4-64 produceerde bijvoorbeeld suboptimale resultaten in vergelijking met de plasmamembraan FP-marker, p Zm PIP2-1::ZmPIP2-1:CFP39 (PIP2-1-CFP; Figuur 3A-D). Om deze beperking te overwinnen, raden we aan om een vibratoom te gebruiken om dunnere weefselsecties (~ 0,1 mm) 58 te produceren die een levendige helderveldbeeldvorming van celcontouren mogelijk maken of het contrastainingprotocoloptimaliseren 47,59.
In protocolsectie 3 is de belangrijkste beperking de moeilijkheid om het blad te monteren zonder scheuren, beschadiging of luchtbellen, zoals beschreven in protocolstappen 3.2.5-3.2.6 (figuur 3E-K). Omdat het maïsblad bilateraal symmetrisch is, kan een halfbladige montage in plaats van een hele bladbevestiging voldoende zijn voor visualisatie9. Om dit te doen, kan het primordium met een scheermesje langs de lengteas worden gesneden nadat het tot aan de middenrib is uitgerold, waardoor slechts de helft van het blad kan worden gemonteerd. Een andere beperking van protocolsectie 3 is dat de dikte van het blad de optische resolutie van het fluorofoorsignaal tijdens diepe beeldvorming kan beperken. Om dit probleem aan te pakken, is het mogelijk om een weefselreinigingstechniekte gebruiken 60. We ontdekten echter dat ClearSee61, een veelgebruikt opruimreagens voor het afbeelden van plantenweefsels, niet compatibel is met het protocol omdat het ervoor zorgt dat het monster en de coverslip loskomen van de nanotape. Een mogelijke oplossing voor dit probleem zou kunnen zijn om een semipermeabel membraan31 over het bladmonster aan te brengen, waardoor het kan worden behandeld met de clearingoplossing terwijl het op zijn plaats wordt gehouden door de nanotape. Een dergelijke methode waarmee vloeibare oplossingen op het uitgerolde blad kunnen worden aangebracht, zou ook kunnen worden gebruikt voor whole-mount RNA in situ hybridisatie en immunolocalisatietechnieken, die eerder zijn geoptimaliseerd voor het ontwikkelen van maïsbloeiwijzen, maar niet voor primordia62,63 van het hele blad.
We beschreven protocollen voor maïs, die zelfs in het zaailingstadium grote bladprimordia heeft. Andere grassoorten met veel kleinere bladprimordia, zoals rijst, gerst, tarwe, Setaria en Brachypodium 16,23,64,65,66, kunnen het gebruik van extra precisiegereedschappen vereisen om deze protocollen effectief toe te passen. Bovendien waren deze protocollen niet bedoeld voor beeldvorming van levende cellen, die real-time dynamische processen van weefselvorming en cellulaire reacties vastlegt. Naarmate fluorescerende sondes, beeldvormingstechnologieën en computermogelijkheden zich echter blijven ontwikkelen in live cell imaging voor planten67, zou toekomstig onderzoek kunnen voortbouwen op deze protocollen om live cell imaging-strategieën te ontwikkelen die zijn afgestemd op de unieke kenmerken van grasbladprimordia.

Grasgewassen zijn een belangrijke bron van voedsel en biobrandstof voor de wereldbevolking1, en het verbeteren van de bladanatomie heeft het potentieel om hun productiviteit te verhogen 2,3. Ons huidige begrip van hoe bladanatomie wordt gereguleerd in grassen is echter beperkt4 en vereist de analyse van bladprimordia, omdat veel anatomische en fysiologische kenmerken van het blad vroeg in de ontwikkeling vooraf zijn bepaald 5,6,7. Cellulaire beeldvormingstechnieken, zoals fluorescentie en confocale beeldvorming, zijn onmisbaar voor het bestuderen van de anatomie van grasbladeren en cellulaire eigenschappen, maar deze technieken zijn moeilijk toe te passen op primordia van grasbladeren omdat ze diep zijn ingebakken en in de bladkrans zijn gerold. We hebben dit probleem aangepakt door methoden te ontwikkelen voor het voorbereiden van dwarsdoorsneden en uitgerolde hele bladbevestigingen voor fluorescentie en confocale analyse van maïsbladprimordia, een modelsysteem voor het bestuderen van de anatomie en ontwikkeling van grasbladeren 2,8.
Het maïsblad bestaat, zoals alle grasbladeren, uit een riemachtig blad met een schede dat zich om de stengel wikkelt en zich ontwikkelt tot scheut 9,10,11,12,13. De bladeren ontwikkelen zich uit het scheut-apicale meristeem (SAM) in een distichous-patroon, waarbij elk nieuw blad in de tegenovergestelde positie van het vorige blad begint, wat resulteert in twee rijen bladeren langs de verticale as (figuur 1A)14 . Het ontwikkelingsstadium van elk blad primordium wordt geïdentificeerd door zijn positie ten opzichte van de SAM, waarbij het dichtstbijzijnde primordium wordt aangeduid als plastochron1 (P1) en de volgende primordia wordt aangeduid als P2, P3, enzovoort (figuur 1B, C) 2. Tijdens de ontwikkeling (figuur 1D) verschijnt het blad primordium eerst als een halvemaanvormige steunbeer rond de basis van de SAM (P1), en groeit vervolgens uit tot een kapvormig primordium dat zich uitstrekt over het meristeem (P2)9,10,11. De basale randen van de kap breiden zich vervolgens zijdelings uit en overlappen elkaar naarmate de punt naar boven groeit en een kegelvormig primordium (P3-P5)10 vormt. Het primordium groeit dan snel in lengte en de schede-bladgrens aan de basis wordt prominenter met de vorming van de ligule, de franjeachtige projectie aan de adaxiale kant van het blad (P6/P7). Ten slotte ontrolt het blad zich als het uit de krans komt tijdens steady-state groei, waarbij de delende cellen beperkt zijn binnen het kleine basale gebied van het blad, waardoor een gradiënt wordt gevormd met uitzettende en differentiërende cellen langs de proximaal-distale as (P7 / P8)15. De scheuttop van een maïszaailing bevat meerdere primordia in verschillende stadia van ontwikkeling, waardoor het een uitstekend model is voor het bestuderen van bladontwikkeling8.
Nauwkeurige analyse van vroege bladontwikkeling vereist stadiëring of het gebruik van gestandaardiseerde criteria om verschillende stadia van primordiumontwikkeling te definiëren in relatie tot andere groei- of morfologische parameters. Omdat de bladprimordia verborgen zijn in de grasscheut, gebruiken onderzoekers meestal parameters zoals de leeftijd van de plant of de grootte van de opkomende bladeren als voorspellers voor de stadia en maten van de bladprimordia 9,16. In maïs wordt de chronologische leeftijd van de plant bepaald door het aantal dagen na het planten of ontkiemen (DAP/DAG)17,18. Het vegetatieve stadium (V-stadium) wordt bepaald door het bovenste blad met een zichtbare kraag, een bleke lijn aan de abaxiale zijde tussen het blad en de schede die overeenkomt met de positie van de ligule en oorschelpen, een paar wigvormige gebieden aan de basis van het blad (figuur 1A,B)17,19 . Tussen 20 en 25 DAG gaat de SAM over in een bloeiwijze meristeem en stopt met het produceren van nieuwe bladeren20. De groeisnelheden van maïsblad primordia kunnen variëren afhankelijk van de omgeving en het genotype van de plant. Om deze reden kunnen de leeftijd van de plant en de grootte van de opkomende bladeren de grootte van bladprimordia niet nauwkeurig voorspellen; Het gebruik van deze parameters kan echter helpen bij het voorspellen van het bereik van primordia-stadia en -groottes voor experimentele doeleinden.
Transversale sectieanalyse is een populaire methode voor het onderzoeken van bladanatomie en ontwikkeling in maïs en andere grassen, omdat het de bemonstering van meerdere plastochronen in een enkele sectie over de scheut21,22,23 mogelijk maakt. Deze methode is ook handig voor cellulaire beeldvorming van verse monsters, omdat de omliggende bladeren dienen als een steiger die de bladprimordia op zijn plaats houdt tijdens het doorsneden en monteren24. Een nadeel van deze methode is echter dat het een uitdaging kan zijn om het doelplastochron en het gebied in het primordium nauwkeurig te lokaliseren bij het snijden van een intacte scheut. Omdat de bladgroei varieert tussen plastochronen en langs de proximaal-distale as2,5, kan onnauwkeurige bemonstering bovendien leiden tot een onjuiste interpretatie van het ontwikkelingsstadium en het gebied van het primordium in een bepaalde sectie. Daarom is het ontwikkelen van een methode voor nauwkeurige transversale doorsnedebemonstering van cruciaal belang om de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van anatomische en ontwikkelingsanalyses van grasbladprimordia te waarborgen.
Analyse van de hele bladmontage maakt het uitgebreide en integratieve onderzoek mogelijk van weefsel- en cellulaire processen die plaatsvinden op de schaal van het hele orgaan, zoals proliferatieve groei25 en aderpatronen26,27,28. De methode biedt een paradermale overzicht van het blad, waardoor verschillende processen en patronen kunnen worden ontdekt die anders moeilijk te detecteren zouden zijn met behulp van transversale sectieanalyse24,27. Anders dan in Arabidopsis, waar er al gevestigde methoden zijn voor het in beeld brengen van hele bladbevestigingen29,30, is er momenteel geen standaardmethode voor het in beeld brengen van uitgerolde hele bladbevestigingen in grassen. Een eerder protocol voor het uitrollen van geïsoleerde maïsbladprimordia betrof ongebruikelijke materialen en was niet geschikt voor cellulaire beeldvorming31. Geavanceerde beeldvormingstechnieken, zoals computertomografie (CT) en magnetische resonantiebeeldvorming (MRI), kunnen 3D-anatomische informatie verkrijgen zonder de primordia 11,32,33 te isoleren en uit te rollen, maar ze zijn duur en vereisen gespecialiseerde apparatuur. Het ontwikkelen van een techniek om de beperkingen te overwinnen die worden opgelegd door de gewalste en conische morfologie van bladprimordia in maïs en andere grassen, zou het onderzoek naar hun anatomische en ontwikkelingskenmerken bevorderen.
Hier presenteren we methoden voor het voorbereiden van dwarsdoorsneden en ontrolde hele bergen van maïsblad primordia voor fluorescentie en confocale beeldvorming. We gebruikten deze methoden om het adergetal te kwantificeren en de ruimtelijk-temporele hormoonverdeling in maïsblad primordia in kaart te brengen met fluorescerende eiwitten (FP's)24. De eerste methode omvat het verwijderen van het bovenste deel van oudere bladeren van maïszaailingen met een draadstripper (figuur 1E). Door de punt van het primordium (P5-P7) bloot te leggen, wordt het mogelijk om de lengte ervan te bepalen zonder de oudere omliggende bladeren volledig te hoeven verwijderen, waardoor eenvoudig en nauwkeurig snijden mogelijk is. De tweede methode omvat het uitrollen en monteren van primordia van hele bladeren (P3-P7) met heldere, dubbelzijdige nanotape (figuur 1F). Deze methoden zijn geschikt voor het visualiseren van verschillende FP's24, maar moeten worden geoptimaliseerd voor het gebruik van fluorescerende kleurstoffen en zuiverende reagentia. Daarnaast schetsen we enkele procedures voor het afvlakken van z-stacks, het naaien van afbeeldingen en het samenvoegen van kanalen in ImageJ / FIJI34, die van toepassing zijn op de afbeeldingen die door de twee methoden worden geproduceerd. Deze methoden zijn nuttig voor routinematige fluorescentie of confocale beeldvorming van maïsbladeren, maar ze kunnen ook worden aangepast voor andere modelgrassoorten, zoals rijst, Setaria en Brachypodium.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig01.jpg"> Figuur 1: Organisatie en morfologie van maïsblad primordia en overzicht van de methoden . (A) Schematische weergave van een maïszaailing. Maïs heeft een distichous phyllotaxy, waarbij het nieuwe blad op de tegenovergestelde positie van het vorige blad begint. Het bladnummer geeft de chronologische volgorde aan waarin de bladeren uit de kieming zijn voortgekomen (d.w.z. eerste blad, L1; tweede blad, L2; derde blad, L3; enz.). Elk blad heeft een distale blade en een basale schede afgebakend door een kraag die overeenkomt met de ligule en de oorschelp. Het bovenste blad met de kraag zichtbaar duidt op het vegetatieve stadium. De zaailing in dit voorbeeld bevindt zich in het V2-stadium, waarbij de L2-kraag (pijlpunt) zichtbaar is. Het schaarpictogram geeft de locatie aan bij de mesocotyl (me) waar de zaailing moet worden geknipt om te worden verzameld. (B) Schematische weergave van de ontleedde scheut met geïsoleerde L1 tot L4, met de bladprimordia L5 tot L9 weergegeven als een vergrote afbeelding in (C). Het plastochrongetal geeft de positie van het primordium ten opzichte van de SAM aan, waarbij het jongste blad primordium (P1) het dichtst bij de SAM ligt en het oudere blad primordia (P2, P3, P4, enzovoort) achtereenvolgens verder weg2. (D) Schematische weergave van de morfologie van primordia van maïsbladeren van P1 tot en met P5. (E) Schematisch overzicht van de methode voor de dwarsdoorsnedeanalyse van de primordia van maïsblad. (1) Knip de oudere bladeren af met een draadstripper. (2) Meet het primordium en snijd de scheut. (3) Monteer de sectie op een dia voor beeldvorming en verwerking (4, 5). F) Schematisch overzicht van de methode voor de analyse van het maïsblad primordia. (1) Verwijder de omliggende bladeren om het primordium te extraheren. (2) Knip en rol het primordium plat op de nanotape. (3) Monteer het monster voor beeldvorming en verwerking (4, 5). Afkortingen: L = blad; bl = blad; sh = schede; co = kraag; me = mesocotyl; V = vegetatief; P = plastochron; SAM = schiet apicale meristeem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylic Gel Clear Double Sided Nano Tape 16.5 ft x 1.2 in, 2 mm thick</td>
			<td>EZlifego Store (Amazon)</td>
			<td>B07YB1ZXG6</td>
			<td>1 roll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bellucci Pick Curved micro probe 16.8 cm, 6.6 in</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>N1692 9</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clayman guide microprobe Sinskey hook angled shaft, 11.6 cm, 4.6 in</td>
			<td>Storz Opthalmic Instruments</td>
			<td>E0542</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Probe, Bent Needle, 14 cm (5.5 in)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>13553</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWELL 10-22 AWG Wire Stripper</td>
			<td>Dowell Store (Amazon)</td>
			<td>10-22 AWG</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Double Edge Carbon Steel Blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-9</td>
			<td>pkg/10; for fine sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted End Glass Microscope Slides, 75 mm x 25 mm x 1-1.2 mm</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260442</td>
			<td>pkg/144</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEM Single Edge, Stainless Steel Uncoated Blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-1</td>
			<td>box/200; for general cutting/sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI17904</td>
			<td>1 liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FIJI with EDF plugin (version 17.05.2021) and Grid/Collection Stitching plugin</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH) USA</td>
			<td>version 2.9.0/1.54s</td>
			<td>The EDF plugin was developed by Alex Prudencio, Jesse Berent, and Daniel Sage for the Biomedical Imaging Group, &#201;cole Polytechnique F&#233;d&#233;rale de Lausanne (EPFL; http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/). The grid/collection stitching software was developed by Stephan Preibisch for the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Ex-L Small 111.76 mm x 213.36 mm</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>34155</td>
			<td>box/280 ply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, 22 mm x 22 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260140</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PU Gel Clear Double Sided Nano Tape 29.5 ft x 1.18 in, 1 mm thick</td>
			<td>Yecaye Store (Amazon)</td>
			<td>L354 W1.18</td>
			<td>2 rolls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superslip Cover Glasses, 24 mm x 50 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260166</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superslip Cover Glasses, 24 mm x 60 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260168</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempered Glass Cutting Board</td>
			<td>Hacaroa (Amazon)</td>
			<td>B09XMXBT5S</td>
			<td>4 pc</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging

In maïs (Zea mays) en andere grassen (Poaceae) zijn de blad primordia diep ingekapseld en gerold in de bladkrans, waardoor het moeilijk is om de vroege bladontwikkeling te bestuderen. Hier beschrijven we methoden voor het voorbereiden van dwarsdoorsneden en uitgerolde hele mounts van maïsblad primordia voor fluorescentie en confocale beeldvorming. De eerste methode maakt gebruik van een draadstripper om de bovenste delen van oudere bladeren te verwijderen, waardoor de punt van het blad primordium wordt blootgesteld en de meting ervan mogelijk is voor nauwkeurigere transversale bemonstering. De tweede methode maakt gebruik van heldere, dubbelzijdige nanotape om primordia van het hele blad uit te rollen en te monteren voor beeldvorming. We tonen het nut van de twee methoden bij het visualiseren en analyseren van fluorescerende eiwitreporters in maïs. Deze methoden bieden een oplossing voor de uitdagingen van de kenmerkende morfologie van maïsblad primordia en zullen nuttig zijn voor het visualiseren en kwantificeren van anatomische en ontwikkelingskenmerken van bladeren in maïs en andere grassoorten.

Grass crops are a major source of food and biofuel for the global population1, and improving leaf anatomy has the potential to increase their productivity2,3. However, our current understanding of how leaf anatomy is regulated in grasses is limited4 and requires the analysis of leaf primordia, as many anatomical and physiological traits of the leaf are predetermined early in development5,6,7. Cellular imaging techniques, such as fluorescence and confocal imaging, are indispensable for studying grass leaf anatomy and cellular traits, but these techniques are difficult to apply to grass leaf primordia because they are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl. We addressed this issue by developing methods for preparing transverse sections and unrolled whole-leaf mounts for fluorescence and confocal analysis of maize leaf primordia, a model system for studying grass leaf anatomy and development2,8.
The maize leaf, like all grass leaves, consists of a strap-like blade with a sheath that wraps around the stem and developing shoot9,10,11,12,13. The leaves develop from the shoot apical meristem (SAM) in a distichous pattern, where each new leaf initiates in the opposite position of the previous leaf, resulting in two ranks of leaves along the vertical axis&#160;(Figure 1A)14 . The developmental stage of each leaf primordium is identified by its position relative to the SAM, with the closest primordium designated as plastochron1 (P1) and the following primordia designated as P2, P3, and so on (Figure 1B,C)2. During development (Figure 1D), the leaf primordium first appears as a crescent-shaped buttress around the base of the SAM (P1), and then grows into a hood-shaped primordium that extends over the meristem (P2)9,10,11. The basal margins of the hood then expand laterally and overlap each other as the tip grows upward, forming a cone-shaped primordium (P3-P5)10. The primordium then rapidly grows in length, and the sheath-blade boundary at the base becomes more prominent with the formation of the ligule, the fringe-like projection on the adaxial side of the leaf (P6/P7). Finally, the leaf unrolls as it emerges from the whorl during steady-state growth, in which the dividing cells are restricted within the small basal region of the blade, forming a gradient with expanding and differentiating cells along the proximal-distal axis (P7/P8)15. The shoot apex of a maize seedling contains multiple primordia at different stages of development, making it an excellent model for studying leaf development8.
Accurate analysis of early leaf development requires staging or the use of standardized criteria to define distinct stages of primordium development in relation to other growth or morphological parameters. Because the leaf primordia are hidden within the grass shoot, investigators typically use parameters such as the age of the plant or the size of the emerging leaves as predictors for the stages and sizes of the leaf primordia9,16. In maize, the chronological age of the plant is determined either by the number of days after planting or germination (DAP/DAG)17,18. The vegetative stage (V stage) is determined by the uppermost leaf with a visible collar, a pale line on the abaxial side between the blade and the sheath that corresponds to the position of the ligule and auricles, a pair of wedge-shaped regions at the base of the blade&#160;(Figure 1A,B)17,19 . Between 20 and 25 DAG, the SAM transitions into an inflorescence meristem and ceases to produce new leaves20. The growth rates of maize leaf primordia can vary depending on the environment and the genotype of the plant. For this reason, plant age and the size of the emerging leaves cannot accurately predict the sizes of leaf primordia; however, using these parameters can help predict the range of primordia stages and sizes for experimental purposes.
Transverse section analysis is a popular method for examining leaf anatomy and development in maize and other grasses because it allows for the sampling of multiple plastochrons in a single section across the shoot21,22,23. This method is also convenient for cellular imaging of fresh samples, as the surrounding leaves serve as a scaffold&#160;that keeps the leaf primordia in place during sectioning and mounting24. However, a disadvantage of this method is that it can be challenging to precisely locate the target plastochron and region within the primordium when sectioning from an intact shoot. Furthermore, because leaf growth varies across plastochrons and along the proximal-distal axis2,5, imprecise sampling could result in an incorrect interpretation of the developmental stage and region of the primordium in a given section. Therefore, developing a method for precise transverse section sampling is critical for ensuring the accuracy and reproducibility of anatomical and developmental analyses of grass leaf primordia.
Whole-leaf mount analysis enables the comprehensive and integrative investigation of tissue and cellular processes that occur at the whole-organ scale, such as proliferative growth25 and vein patterning26,27,28. The method provides a paradermal overview of the leaf, allowing the discovery of distinct processes and patterns that would otherwise be difficult to detect using transverse section analysis24,27. Unlike in Arabidopsis, where there are already established methods for imaging whole-leaf mounts29,30, there is currently no standard method for imaging unrolled whole-leaf mounts in grasses. A previous protocol for unrolling isolated maize leaf primordia involved uncommon materials and was not suitable for cellular imaging31. Advanced imaging techniques, such as computed tomography (CT) and magnetic resonance imaging (MRI), can acquire 3D anatomical information without isolating and unrolling the primordia11,32,33, but they are expensive and require specialized equipment. Developing a technique to overcome the constraints imposed by the rolled and conical morphology of leaf primordia in maize and other grasses would advance investigations into their anatomical and developmental traits.
Here, we present methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging. We used these methods to quantify vein number and map the spatial-temporal hormone distribution in maize leaf primordia with fluorescent proteins (FPs)24. The first method involves removing the upper portion of older leaves from maize seedlings with a wire stripper (Figure 1E). By exposing the tip of the primordium (P5-P7), it becomes possible to determine its length without having to completely remove the older surrounding leaves, thus enabling easy and accurate sectioning. The second method involves unrolling and mounting whole-leaf primordia (P3-P7) with clear, double-sided nano tape (Figure 1F). These methods are suitable for visualizing various FPs24&#160;but need optimization for using fluorescent dyes and clearing reagents. In addition, we outline some procedures for flattening z-stacks, stitching images, and merging channels in ImageJ/FIJI34, which apply to the images produced by the two methods. These methods are useful for routine fluorescence or confocal imaging of maize leaves, but they can also be adapted for other model grass species, such as rice, Setaria, and Brachypodium.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig01.jpg" /> 
Figure 1: Organization and morphology of maize leaf primordia and overview of the methods. (A) Schematic representation of a maize seedling. Maize has a distichous phyllotaxy, with the new leaf initiating at the opposite position of the previous leaf. The leaf number indicates the chronological order in which the leaves emerged from germination (i.e., first leaf, L1; second leaf, L2; third leaf, L3; etc.). Each leaf has a distal blade and a basal sheath delineated by a collar that corresponds to the ligule and auricle. The uppermost leaf with the collar visible denotes the vegetative stage. The seedling in this example is at the V2 stage, with the L2 collar (arrowhead) visible. The scissors icon indicates the location at the mesocotyl (me) where the seedling must be cut in order to be collected. (B) Schematic representation of the dissected shoot showing isolated L1 to L4, with the leaf primordia L5 to L9 shown as an enlarged image in (C). The plastochron number indicates the position of the primordium relative to the SAM, with the youngest leaf primordium (P1) closest to the SAM and the older leaf primordia (P2, P3, P4, and so on) successively farther away2. (D) Schematic representation of the morphology of maize leaf primordia from P1 to P5. (E) Schematic overview of the method for transverse section analysis of the maize leaf primordia. (1) Trim the older leaves with a wire stripper. (2) Measure the primordium and section the shoot. (3) Mount the section on a slide for imaging and processing (4, 5). (F) Schematic overview of the method for whole-mount analysis of the maize leaf primordia. (1) Remove the surrounding leaves to extract the primordium. (2) Cut and unroll the primordium flat on the nano tape. (3) Mount the sample for imaging and processing (4, 5). Abbreviations: L = leaf; bl = blade; sh = sheath; co = collar; me = mesocotyl; V = vegetative; P = plastochron; SAM = shoot apical meristem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Auteur in de schijnwerpers: verbeterde methoden voor het voorbereiden van dwarsdoorsneden en uitgerolde hele mounts van maïsbladprimordia voor fluorescentie en confocale beeldvorming  

Verbeterde methoden voor het voorbereiden van dwarsdoorsneden en het uitrollen van hele bergen van primordia van maïsbladeren voor fluorescentie en confocale beeldvorming

Grasses like maize have leaf primordia grow within the shoot, making them difficult to study. We address this problem with improved protocols for preparing maize leaf transverse sections and whole mounts for fluorescence and confocal imaging. The first protocol uses a wire stripper to cut the older leaves, allowing the measurement of the primordium prior to sectioning.The second protocol uses clear, double-sided nano tape to unroll whole leaf primordium. These protocols improve the accuracy of transverse sectioning and enable unrolling of the leaf primordia, which have been very difficult to achieve due to their rolled, conical morphology. These methods will be useful for visualizing and quantifying leaf anatomical and developmental traits in maize and other grasses.Based on these methods, we plan to develop live cell imaging strategies to address questions in grass leaf development.

Dwarsdoorsnedeanalyse van primordia van maïsbladeren We gebruikten protocolsectie 2 om het aderaantal te kwantificeren en hormoonresponspatronen in dwarsdoorsneden van maïsblad primordia te karakteriseren met FP's (figuur 4)24. Om de rol van het plantenhormoon auxine in bladgroei en adervorming te beoordelen, kwantificeerden we het aantal nerven in de bladprimordia van een auxine-deficiënte maïsmutant, verdwijnende kwast254. In vroege plastochronen vertonen zich ontwikkelende aders een duidelijke cellularisatie in de mediane cellaag van het maïsblad primordium21,22. Het identificeren en tellen van aderen met behulp van conventionele histologische technieken22 kan echter arbeidsintensief en tijdrovend zijn. Om de aderen te kwantificeren, gebruikten we dus de maïs auxine efflux eiwitmarker p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP41 (PIN1a-YFP hierna), die zich ontwikkelende aderen en procambiale strengen (PCS'en; Figuur 4A). Met behulp van protocolsectie 2 konden we de transversale sectiebemonstering standaardiseren door de primordia voorafgaand aan de sectie te meten (figuur 4B, C). We ontdekten een trend waarbij vt2 een breder primordium en meer nerven heeft dan normaal (figuur 4D,E)24, wat consistent is met gegevens van volledig geëxpandeerde bladeren55, wat aangeeft dat het defect in vt2 vroeg in de bladontwikkeling begon. Met behulp van protocolsectie 2 konden we ook systematisch de expressiepatronen van hormoonrespons FP-reporters in de bladprimordia onderzoeken (zie voorbeelden van de afbeeldingen in figuur 4F-I). Door middel van een gestandaardiseerd transversaal bemonsteringsschema brachten we de verdeling van auxine-, cytokinine- (CK) en gibberellinezuur (GA) -responsen in kaart over verschillende plastochronen en regio's van bladprimordia, en ontdekten we nieuwe responspatronen waarvan we veronderstellen dat ze implicaties hebben voor bladgroei en adervorming24. Daarom tonen deze representatieve resultaten het nut aan van protocolsectie 2 voor transversale sectieanalyse van maïsbladprimordia.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig04.jpg"> Figuur 4: Representatieve resultaten voor transversale analyse van maïsbladprimordia. (A-E) Kwantificering van het aantal aders en de primordiumbreedte in bladprimordia van normale en verdwijnende kwast2 met de auxine-effluxeiwitmarker PIN1a-YFP. (A) Representatieve fluorescentiebeelden van dwarsdoorsneden van P5 tot P7 die PIN1a-YFP tot expressie brengen in zich ontwikkelende aderen en procambiale strengen. De dwarsdoorsneden werden in beeld gebracht met een epifluorescentiemicroscoop met behulp van een FITC-filter (495-519 nm excitatie). Het aantal aders en de primordiumbreedte werden gekwantificeerd met behulp van de meerpunts- en vrijehandslijngereedschappen in respectievelijk FIJI / ImageJ. (B) Een maïszaailing waarvan de bovenste bladkransen met een draadstripper worden verwijderd om de punt van het vierde blad (L4) bloot te leggen. De beugel overspant de geprojecteerde primordiumlengte, waarbij de stippellijn de middelste lengte aangeeft. (C) Schematisch diagram van verschillende primordiumvormen van P5 tot P7, dat illustreert hoe het adergetal en de primordiumbreedte op de middelste lengte (horizontale stippellijn) kunnen variëren afhankelijk van het ontwikkelingsstadium van het primordium. (D,E) Meting van primordiumbreedte (D) en adergetal (E) in het middenlengtegedeelte van de L4 van normaal en vt2. De trendlijn vertegenwoordigt 10 mm voortschrijdende gemiddelden van metingen ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). (F-I) Representatieve confocale beelden van dwarsdoorsneden van blad primordia die combinaties van PIN1a-YFP, auxine response reporter, DR5-RFP, cytokinin response reporter, TCS-Tomato, gibberellinezuur-responsieve marker, GAR2-YFP en mDII-Venus, een gemuteerde versie van de auxine signaling input reporter DII-Venus. De FP-kanalen worden in elke afbeelding over het helderveldkanaal geplaatst. Schaalbalk = 200 μm (A); 10 mm (B); 100 μm (F-I). Deze figuur is aangepast en gereproduceerd met toestemming van Robil en McSteen24. Afkortingen: DAG = dagen na ontkieming; P = plastochron; vt2 = verdwijnende kwast2; PCS = procambiale streng; YFP = geel fluorescerend eiwit; FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat; RFP = rood fluorescerend eiwit; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; TCS-Tomaat = TCSv2::NLS-tdTomato; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; mDII-Venus = pZmUbi:mDII:YFP-NLS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Analyse van de primordia van maïsbladeren We volgden protocolsectie 3 om FP-expressie te visualiseren en te analyseren in hele bladbevestigingen van primordia van maïsbladeren (figuur 5). Door aderpatronen te visualiseren met PIN1a-YFP, ontdekten we dat de vorming van aderen optreedt in het hele primordium tijdens vroege plastochrons, maar dit proces wordt beperkt in de proximale regio's later in de ontwikkeling (figuur 5A)24. In aanvulling op de transversale sectieanalyses hebben de analyses van de hele bladmontage weefsel- en stadiumspecifieke patronen van hormoonrespons tijdens adervorming aan het licht gebracht24. Een voorbeeld is het expressiepatroon van de CK-responsreporter TCSv2::NLS-tdTomato37 (TCS-Tomato), ten opzichte van de PIN1a-YFP-expressie (Figuur 5B)24. Door protocolsectie 3 te volgen, konden we zowel kwalitatieve als kwantitatieve analyses van FP-expressie in de bladprimordia uitvoeren (figuur 5D-F; ongepubliceerde gegevens). We onderzochten de expressiepatronen van een auxineresponsreporter, DR5rev::mRFPer41 (DR5-RFP), en een GA-responsieve marker, p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP39 (GAR2-YFP), in hele-bladbevestigingen van enkele en dubbele mutanten van vt2 en dwergplant3 (d3), een GA-deficiënte mutant56 (Figuur 5D). We vergeleken ook de relatieve niveaus van celproliferatie tussen normale en vt2-bladprimordiamet behulp van p Zm Cyclin-D2B::ZmCyclin-D2B:YFP 42 (Cyclin-D2B-YFP), wat een marker is voor de G1/S-overgang in de celcyclus 57 (figuur 5E,F). Hoewel er geen significant verschil was tussen normaal en vt2, was cycline-D2B-YFP-expressie consistent met het bekende celproliferatieprofiel van vroege plastochronen31. We concluderen dat protocolsectie 3 een effectieve methode is voor het analyseren van hele bergen van maïsbladprimordia, die moeilijk in beeld te brengen zijn vanwege hun gerolde morfologie.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig05.jpg"> Figuur 5: Representatieve resultaten voor de analyse van maïsbladprimordia. (A) Representatieve fluorescentiebeelden van bladprimordia van 7 DAG-maïszaailingen die zich ontwikkelende aders en procambiale strengen laten zien, zoals gemarkeerd door de auxine-effluxeiwitmarker PIN1a-YFP. P3-P6 primordia werden uit de basis weggesneden, uitgerold en afgeplat met de adaxiale kant naar boven. Inzetstukken tonen close-ups van P3 en P4. In P5 en P6 bakenen stippellijnen het distale uiteinde van de proliferatieve zones af, waar de meeste procambiale strengen zich nog steeds ontwikkelen en uitbreiden. (B,C) Representatieve confocale beelden die de expressie van PIN1a-YFP en cytokinine response reporter, TCS-Tomato, in het proximale marginale gebied van een P5 primordium tonen. (D) Representatieve fluorescentiebeelden van P4 primordia met de expressie van auxineresponsreporter, DR5-RFP en gibberellinezuur-responsieve marker, GAR2-YFP in normale en enkele en dubbele mutanten van verdwijnende kwast2 en dwergplant3. (E) Representatieve confocale beelden van P3 en/of P4 die de expressie tonen van Cyclin-D2B-YFP, een reporter voor de G1/S-overgang in de celcyclus. (F) Relatieve hoeveelheden celproliferatie in P3/P4-blad primordia van normaal en vt2, gekwantificeerd door de geïntegreerde dichtheid van het Cyclin-D2B-YFP-signaal over het gebied van het primordium te meten met behulp van ImageJ/FIJI. De staven vertegenwoordigen de gemiddelde metingen ± standaardfout van het gemiddelde. Schaalbalk = 500 μm (A,D,E); 200 μm (B); 100 μm (C). Figuur 4A-C is aangepast en gereproduceerd met toestemming van Robil en McSteen24, terwijl Figuur 4D-F ongepubliceerde gegevens van de auteurs is. Afkortingen: DAG = dagen na ontkieming; P = plastochron; vt2 = verdwijnende kwast2; d3 = dwergplant3; YFP = geel fluorescerend eiwit; RFP = rood fluorescerend eiwit; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; TCS-Tomaat = TCSv2::NLS-tdTomato; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; Cyclin-D2B-YFP = p Zm Cyclin-D2B::ZmCyclin-D2B:YFP; ns = geen significant verschil; au = willekeurige eenheid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullend dossier 1: Voorbeelden van bladontwikkelingsstadiëring in maïszaailingen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239_S_File_1_Leaf_staging_maize_seedling_Fall2019%20(1).xlsx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende figuur S1: Plantenmonsters en materialen die in de protocollen worden gebruikt. (A,B) Een maïszaailing 7-8 DAG met de bovenste bladkrans verwijderd met behulp van een draadstripper. (B) De inzet toont een close-up van de opname met het blootgestelde P6-primordium. (C-G) Scheuten van maïszaailingen waarvan de bovenste kransen zijn verwijderd voor analyse van de dwarsdoorsnede (C,D) en de omliggende bladeren volledig zijn verwijderd voor analyse van de gehele montage (E-G). (H) Een rol polyurethaangel heldere dubbelzijdige nanotape. (I,J) P6-blad primordium (I) en proximaal gebied van P8-blad (J) uitgerold en gemonteerd op glasglaasjes met de nanotape. (K) Een glasplaat met een uitgerold blad primordium gemonteerd op het stadium van een epifluorescentiemicroscoop. Afkorting: DAG = dagen na ontkieming. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/S_FIGURE_1.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging at JoVE.com

Maïsblad primordia zijn diep verwarmd en gerold, waardoor ze moeilijk te bestuderen zijn. Hier presenteren we methoden voor het voorbereiden van dwarsdoorsneden en ontrolde hele bergen van maïsblad primordia voor fluorescentie en confocale beeldvorming.

In maize (Zea mays) and other grasses (Poaceae), the leaf primordia are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl, making it difficult to study ...

Grassen zoals maïs hebben blad primordia groeien in de scheut, waardoor ze moeilijk te bestuderen zijn. We pakken dit probleem aan met verbeterde protocollen voor het voorbereiden van dwarsdoorsneden van maïsbladeren en hele mounts voor fluorescentie en confocale beeldvorming. Het eerste protocol maakt gebruik van een draadstripper om de oudere bladeren te snijden, waardoor het primordium voorafgaand aan de sectie kan worden gemeten.Het tweede protocol maakt gebruik van heldere, dubbelzijdige nanotape om primordium van hele bladeren uit te rollen. Deze protocollen verbeteren de nauwkeurigheid van dwarsdoorsneden en maken het uitrollen van de bladprimordia mogelijk, die zeer moeilijk te bereiken waren vanwege hun gerolde, conische morfologie. Deze methoden zullen nuttig zijn voor het visualiseren en kwantificeren van anatomische en ontwikkelingskenmerken van bladeren in maïs en andere grassen.Op basis van deze methoden zijn we van plan om live cell imaging-strategieën te ontwikkelen om vragen in de ontwikkeling van grasbladeren aan te pakken.

Verbeterde methoden voor het voorbereiden van dwarsdoorsneden en het uitrollen van hele bergen van primordia van maïsbladeren voor fluorescentie en confocale beeldvorming

Abstract