저자는 옥수수 유전학 협력, 옥수수 세포 유전체학 프로젝트, Dave Jackson (콜드 스프링 하버 연구소, 뉴욕), Anne W. Sylvester (해양 생물학 연구소, 시카고 대학, 일리노이), Andrea Gallavotti (Rutgers 대학, 뉴저지), Carolyn G. Rasmussen (캘리포니아 대학, 리버 사이드)뿐만 아니라 돌연변이 및 형질 전환 주식을 제공 한 Robert F. Baker와 Alexander Jurkevich에게 감사드립니다. 컨포칼 현미경 검사에 도움을 준 Missouri-Columbia. JMR은 J. William Fulbright Fellowship, Diane P. 및 Robert E. Sharp Fund, National Science Foundation의 식물 게놈 연구 프로그램(IOS-1546873)의 지원을 받았습니다. CDTC, EDCDP 및 RJRR은 DOST-SEI S & T 학부 장학금으로 지원됩니다. DODL은 Fr. Thomas Steinbugler SJ 학업 장학금. RJRR은 Aiducation International–Pathways to Higher Education Scholarship의 지원을 받습니다. 이 작업은 과학 및 공학 학교와 Ateneo de Manila University의 Rizal Library에서 지원했습니다.

Maize Leaf Primordia를 이미징하는 개선된 방법

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

우리는 세포 이미징을 위해 옥수수 잎 원시를 준비하는 두 가지 방법을 제시합니다. 첫 번째 방법(프로토콜 섹션 2)은 횡단면 분석을 위한 원시의 측정을 가능하게 하고, 두 번째 방법(프로토콜 섹션 3)은 전체 마운트 분석을 위한 원시의 언롤링 및 평탄화를 가능하게 합니다. 이러한 방법은 옥수수 잎 원시(24)(그림 4 및 그림 5에 표시됨)에서 FP의 세포 이미징을 용이하게 하고 개발 중인 옥수수 잎을 이미징하는 문제에 대한 간단한 솔루션을 제공합니다. 프로토콜 섹션 2는 해부 시간을 줄이고 스테이징 매개변수 9,16에만 의존하지 않고 절편 전에 원시를 측정하여 샘플링 정확도를 향상시킵니다. 상업적으로 이용 가능한 나노 테이프를 사용하여 프로토콜 섹션 3은 옥수수에서 전체 잎 원시를 이미징하는 오랜 문제를 해결합니다. 이 프로토콜은 투석 튜브(31)를 사용했던 이전의 방법에서 개선되고, CT 및 MRI(11,32,33)에 대한 훨씬 저렴한 대안이다. 그러나 잎의 해부학적 특성을 시각화하고 최적의 결과를 생성하는 데 있어 두 프로토콜 모두 몇 가지 제한 사항이 있으며, 이는 표 2에 요약되어 있으며 아래에서 더 자세히 설명합니다.
프로토콜 섹션 2에서 우리는 잎 원시의 두꺼운 가로 단면에서 세포 윤곽을 시각화하는 데 어려움을 겪었고 세포벽 또는 원형질막 결합 형광 염료로 대조 염색해도 만족스러운 결과를 얻지 못했습니다. 예를 들어, FM 4-64는 원형질막 FP 마커에 비해 차선의 결과를 생성했으며, p Zm PIP2-1::ZmPIP2-1:CFP39 (PIP2-1-CFP; 그림 3A-D). 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 비브라톰을 사용하여 더 얇은 조직 절편(~0.1 mm)을 생성하는 것이 좋습니다.58 세포 윤곽선의 생생한 명시야 이미징을 허용하거나 대조염색 프로토콜 47,59를 최적화할 수 있습니다.
프로토콜 섹션 3에서 주요 제한 사항은 프로토콜 단계 3.2.5-3.2.6(그림 3E-K)에 자세히 설명된 대로 찢어짐, 손상 또는 기포 없이 리프를 장착하는 것이 어렵다는 것입니다. 옥수수 잎은 양측 대칭이기 때문에, 전체 잎 산보다는 반잎 산이 시각화9에 충분할 수 있다. 이렇게하기 위해, primordium은 중추까지 펼친 후 세로축을 따라 면도날로자를 수 있으며, 잎의 절반 만 장착 할 수 있습니다. 프로토콜 섹션 3의 또 다른 한계는 리프의 두께가 딥 이미징 동안 형광단 신호의 광학 분해능을 제한할 수 있다는 것입니다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 조직 투명화 기술(60)을 채용할 수 있다. 그러나 식물 조직 이미징에 일반적으로 사용되는 투명 시약인 ClearSee61은 샘플과 커버슬립이 나노 테이프에서 분리되기 때문에 프로토콜과 호환되지 않는다는 것을 발견했습니다. 이 문제에 대한 잠재적인 해결책은 잎 샘플 위에 반투과성 멤브레인(31)을 도포하여, 나노 테이프에 의해 제자리에 고정되어 있는 동안 투명 용액으로 처리될 수 있도록 하는 것이다. 액체 용액이 펼쳐진 잎에 적용될 수 있도록 하는 이러한 방법은 이전에 옥수수 꽃차례 개발에 최적화되었지만 전체 잎 원시(primordia)에 대해서는 최적화되지 않은 전체 마운트 RNA 제자리 혼성화 및 면역국소화 기술에도 사용될 수 있습니다62,63.
우리는 묘목 단계에서도 큰 잎 원시를 가진 옥수수에 대한 프로토콜을 설명했습니다. 쌀, 보리, 밀, Setaria 및 Brachypodium 16,23,64,65,66과 같이 잎이 훨씬 작은 다른 풀 종은 이러한 프로토콜을 효과적으로 적용하기 위해 추가 정밀 도구를 사용해야 할 수 있습니다. 또한, 이러한 프로토콜은 조직 형성 및 세포 반응의 실시간 동적 과정을 캡처하는 생세포 이미징을 위한 것이 아닙니다. 그러나 형광 프로브, 이미징 기술 및 컴퓨팅 기능이 식물67에 대한 생세포 이미징에서 계속 발전함에 따라 향후 연구는 이러한 프로토콜을 기반으로 잔디 잎 원시의 고유한 특징에 맞는 생세포 이미징 전략을 개발할 수 있습니다.

잔디 작물은 전 세계 인구를 위한 식량 및 바이오 연료의 주요 공급원이며1, 잎 해부학적 구조를 개선하면 생산성을 높일 수 있는 잠재력이 있습니다 2,3. 그러나 풀에서 잎의 해부학이 어떻게 조절되는지에 대한 우리의 현재 이해는 제한적이며4 잎의 많은 해부학적 및 생리학적 특성이 발달 초기에 미리 결정되기 때문에 잎 원시의 분석이 필요합니다 5,6,7. 형광 및 컨포칼 이미징과 같은 세포 이미징 기술은 잔디 잎 해부학 및 세포 특성을 연구하는 데 없어서는 안될 필수 요소이지만, 이러한 기술은 잎 소용돌이 안에 깊숙이 박혀 굴러가기 때문에 잔디 잎 원시에는 적용하기 어렵습니다. 우리는 잔디 잎 해부학 및 발달 연구를 위한 모델 시스템인 옥수수 잎 원시의 형광 및 공초점 분석을 위한 횡단면 및 펼쳐진 전체 잎 마운트를 준비하는 방법을 개발하여 이 문제를 해결했습니다 2,8.
옥수수 잎은 모든 풀 잎과 마찬가지로 줄기를 감싸고 싹 9,10,11,12,13을 발달시키는 칼집이있는 끈 모양의 칼날로 구성됩니다. 잎은 싹 정단 분열조직(SAM)에서 먼 패턴으로 발달하며, 각각의 새 잎은 이전 잎의 반대 위치에서 시작하여 수직축을 따라 두 개의 잎 등급이 됩니다(그림 1A)14. 각 잎 원시의 발달 단계는 SAM에 대한 위치로 식별되며, 가장 가까운 원시는 플라스토크론1(P1)로 지정되고 다음 원시는 P2, P3 등으로 지정됩니다(그림 1B,C)2. 발달하는 동안(그림 1D), 잎 원시는 먼저 SAM(P1)의 기저부 주위에 초승달 모양의 부벽으로 나타난 다음 분열조직(P2)9,10,11 위로 뻗어 있는 후드 모양의 원시로 자랍니다. 그런 다음 후드의 기저 가장자리는 측면으로 확장되고 팁이 위쪽으로 자라면서 서로 겹쳐져 원뿔 모양의 원시(P3-P5)10를 형성합니다. 그런 다음 원시는 길이가 빠르게 증가하고 밑 부분의 칼집 가장자리는 잎의 인접 측면에 프린지 모양의 돌출부 인 결절이 형성됨에 따라 더욱 두드러집니다 (P6 / P7). 마지막으로, 잎은 정상 상태 성장 중에 소용돌이에서 나오면서 펼쳐지며, 분열하는 세포는 잎의 작은 기저 영역 내에서 제한되어 근위-원위 축(P7/P8)15을 따라 확장 및 분화 세포와 함께 구배를 형성합니다. 옥수수 묘목의 싹 정점에는 여러 발달 단계에서 여러 개의 원시가 포함되어 있어 잎 발달을 연구하는 데 훌륭한 모델입니다8.
초기 잎 발달에 대한 정확한 분석은 다른 성장 또는 형태학적 매개변수와 관련하여 원시 발달의 뚜렷한 단계를 정의하기 위한 표준화된 기준의 병기 결정 또는 사용이 필요합니다. 잎 원시는 풀싹 안에 숨겨져 있기 때문에 연구자들은 일반적으로 식물의 나이 또는 출현하는 잎의 크기와 같은 매개 변수를 잎 원시의 단계와 크기에 대한 예측 변수로 사용합니다 9,16. 옥수수에서 식물의 연대순 연령은 심기 또는 발아 후 일수(DAP/DAG)에 의해 결정됩니다.17,18. 식물 단계 (V 단계)는 눈에 보이는 고리가있는 최상층 잎, 결절과 귓바퀴의 위치에 해당하는 칼날과 칼집 사이의 축면에 옅은 선, 잎 바닥에 한 쌍의 쐐기 모양 영역에 의해 결정됩니다 (그림 1A, B) 17,19 . 20에서 25 DAG 사이에서 SAM은 꽃차례 분열 조직으로 전환되고 새로운 잎20 생산을 중단합니다. 옥수수 잎 원시의 성장률은 환경과 식물의 유전자형에 따라 달라질 수 있습니다. 이러한 이유로 식물의 나이와 신생 잎의 크기는 잎 원시의 크기를 정확하게 예측할 수 없습니다. 그러나 이러한 매개변수를 사용하면 실험 목적으로 원시 단계 및 크기의 범위를 예측하는 데 도움이 될 수 있습니다.
횡단면 분석은 싹21,22,23에 걸쳐 단일 섹션에서 여러 플라스토크로를 샘플링할 수 있기 때문에 옥수수 및 기타 풀의 잎 해부학 및 발달을 검사하는 데 널리 사용되는 방법입니다. 이 방법은 또한 신선한 샘플의 세포 이미징에 편리한데, 이는 주변 잎이 절편 및 장착 중에 잎 원시를 제자리에 유지하는 스캐폴드 역할을 하기 때문이다24. 그러나 이 방법의 단점은 온전한 싹에서 절편할 때 원시벽 내에서 표적 플라스토크로와 영역을 정확하게 찾는 것이 어려울 수 있다는 것입니다. 또한, 잎의 성장은 플라스토크론과 근위-원위 축 2,5를 따라 다양하기 때문에 부정확한 샘플링은 주어진 섹션에서 원시의 발달 단계와 영역에 대한 잘못된 해석을 초래할 수 있습니다. 따라서 정확한 횡단면 샘플링 방법을 개발하는 것은 잔디 잎 원시의 해부학적 및 발달적 분석의 정확성과 재현성을 보장하는 데 중요합니다.
전엽 마운트 분석은 증식성 성장25 및 정맥 패턴화26,27,28와 같이 전체 장기 규모에서 발생하는 조직 및 세포 과정에 대한 포괄적이고 통합적인 조사를 가능하게 합니다. 이 방법은 잎의 paradermal 개요를 제공하여 횡단면 분석24,27을 사용하여 감지하기 어려운 뚜렷한 과정과 패턴을 발견할 수 있도록 합니다. 전체 잎 마운트를 이미징하는 방법이 이미 확립된 애기장대와 달리29,30, 현재 풀밭에서 펼쳐지지 않은 전체 리프 마운트를 이미징하는 표준 방법은 없습니다. 분리된 옥수수 잎 원시를 풀기 위한 이전 프로토콜은 흔하지 않은 물질을 포함했으며 세포 이미징에 적합하지 않았습니다31. 컴퓨터 단층 촬영 (CT) 및 자기 공명 영상 (MRI)과 같은 고급 이미징 기술은 원시 11,32,33을 분리 및 펼치지 않고 3D 해부학 적 정보를 획득 할 수 있지만 비용이 많이 들고 특수 장비가 필요합니다. 옥수수와 다른 풀에서 잎 원시의 압연 및 원뿔 형태에 의해 부과된 제약을 극복하기 위한 기술을 개발하면 해부학적 및 발달적 특성에 대한 조사가 진행될 것입니다.
여기에서 우리는 형광 및 공초점 이미징을 위해 옥수수 잎 원시의 횡단면과 펼쳐진 전체 마운트를 준비하는 방법을 제시합니다. 우리는 이러한 방법을 사용하여 정맥 수를 정량화하고 형광 단백질(FP)을 사용하여 옥수수 잎 원시의 시공간 호르몬 분포를 매핑했습니다.24. 첫 번째 방법은 와이어 스트리퍼를 사용하여 옥수수 묘목에서 오래된 잎의 윗부분을 제거하는 것입니다(그림 1E). 원시(P5-P7)의 끝 부분을 노출시킴으로써 주변의 오래된 잎을 완전히 제거하지 않고도 길이를 결정할 수 있어 쉽고 정확한 절편이 가능합니다. 두 번째 방법은 투명한 양면 나노 테이프로 전체 잎 원시(P3-P7)를 펼치고 장착하는 것입니다(그림 1F). 이러한 방법들은 다양한 FP들(24)을 시각화하는데 적합하지만, 형광 염료 및 투명화 시약을 사용하기 위한 최적화가 필요하다. 또한 ImageJ/FIJI34에서 z-스택을 병합하고, 이미지를 결합하고, 채널을 병합하는 몇 가지 절차를 간략하게 설명하며, 이는 두 가지 방법으로 생성된 이미지에 적용됩니다. 이러한 방법은 옥수수 잎의 일상적인 형광 또는 컨포칼 이미징에 유용하지만 벼, Setaria 및 Brachypodium과 같은 다른 모델 잔디 종에도 적용할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig01.jpg"> 그림 1 : 옥수수 잎 원시의 조직과 형태 및 방법의 개요. (A) 옥수수 묘목의 개략도. 옥수수는 새 잎이 이전 잎의 반대 위치에서 시작되는 distichous phyllotaxy를 가지고 있습니다. 잎 번호는 잎이 발아에서 나온 연대순을 나타냅니다(즉, 첫 번째 잎, L1, 두 번째 잎, L2, 세 번째 잎, L3 등). 각 잎에는 원위 칼날과 결절과 귓바퀴에 해당하는 고리로 묘사 된 기저부가 있습니다. 칼라가 보이는 맨 위 잎은 식물 단계를 나타냅니다. 이 예제의 묘목은 V2 단계에 있으며 L2 칼라(화살촉)가 표시됩니다. 가위 아이콘은 묘목을 수집하기 위해 잘라야하는 중배엽 (me)의 위치를 나타냅니다. (B) (C)에서 확대된 이미지로 표시된 잎 원시(Leaf) L5 내지 L9와 함께 분리된 L1 내지 L4를 보여주는 해부된 새싹의 개략도. 플라스토크로 번호는 SAM에 대한 원시의 위치를 나타내며, 가장 어린 잎 원시(P1)가 SAM에 가장 가깝고 오래된 잎 원시(P2, P3, P4 등)가 연속적으로 더 멀리 떨어져 있습니다2. (D) P1에서 P5까지 옥수수 잎 원시의 형태를 도식적으로 표현합니다. (E) 옥수수 잎 원시의 횡단면 분석 방법의 개략도. (1) 와이어 스트리퍼로 오래된 잎을 다듬습니다. (2) 원시를 측정하고 싹을 분할합니다. (3) 이미징 및 처리를 위해 슬라이드에 섹션을 장착합니다(4, 5). (F) 옥수수 잎 원시의 전체 마운트 분석 방법의 개략도. (1) 주변의 잎을 떼어내어 원초를 추출합니다. (2) 나노 테이프에서 원초를 평평하게 자르고 펼칩니다. (3) 이미징 및 처리를 위해 샘플을 장착합니다(4, 5). 약어: L = 잎; BL = 블레이드; sh = 칼집; CO = 칼라; me = 중배엽; V = 식물성; P = 플라스토크로닉; SAM = 싹 정단 분열 조직. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylic Gel Clear Double Sided Nano Tape 16.5 ft x 1.2 in, 2 mm thick</td>
			<td>EZlifego Store (Amazon)</td>
			<td>B07YB1ZXG6</td>
			<td>1 roll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bellucci Pick Curved micro probe 16.8 cm, 6.6 in</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>N1692 9</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clayman guide microprobe Sinskey hook angled shaft, 11.6 cm, 4.6 in</td>
			<td>Storz Opthalmic Instruments</td>
			<td>E0542</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Probe, Bent Needle, 14 cm (5.5 in)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>13553</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWELL 10-22 AWG Wire Stripper</td>
			<td>Dowell Store (Amazon)</td>
			<td>10-22 AWG</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Double Edge Carbon Steel Blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-9</td>
			<td>pkg/10; for fine sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted End Glass Microscope Slides, 75 mm x 25 mm x 1-1.2 mm</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260442</td>
			<td>pkg/144</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEM Single Edge, Stainless Steel Uncoated Blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-1</td>
			<td>box/200; for general cutting/sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI17904</td>
			<td>1 liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FIJI with EDF plugin (version 17.05.2021) and Grid/Collection Stitching plugin</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH) USA</td>
			<td>version 2.9.0/1.54s</td>
			<td>The EDF plugin was developed by Alex Prudencio, Jesse Berent, and Daniel Sage for the Biomedical Imaging Group, &#201;cole Polytechnique F&#233;d&#233;rale de Lausanne (EPFL; http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/). The grid/collection stitching software was developed by Stephan Preibisch for the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Ex-L Small 111.76 mm x 213.36 mm</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>34155</td>
			<td>box/280 ply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, 22 mm x 22 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260140</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PU Gel Clear Double Sided Nano Tape 29.5 ft x 1.18 in, 1 mm thick</td>
			<td>Yecaye Store (Amazon)</td>
			<td>L354 W1.18</td>
			<td>2 rolls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superslip Cover Glasses, 24 mm x 50 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260166</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superslip Cover Glasses, 24 mm x 60 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260168</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempered Glass Cutting Board</td>
			<td>Hacaroa (Amazon)</td>
			<td>B09XMXBT5S</td>
			<td>4 pc</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging

옥수수 (Zea mays)와 다른 풀 (Poaceae)에서 잎 원시는 잎 소용돌이 속에 깊숙이 박혀 굴러있어 초기 잎 발달을 연구하기가 어렵습니다. 여기에서는 형광 및 컨포칼 이미징을 위해 옥수수 잎 원시의 횡단면과 펼쳐진 전체 마운트를 준비하는 방법을 설명합니다. 첫 번째 방법은 와이어 스트리퍼를 사용하여 오래된 잎의 윗부분을 제거하여 잎 원시의 끝을 노출시키고 보다 정확한 횡단면 샘플링을 위해 측정할 수 있도록 합니다. 두 번째 방법은 투명한 양면 나노 테이프를 사용하여 이미징을 위해 전체 잎 원시를 펼치고 장착합니다. 우리는 옥수수에서 형광 단백질 리포터를 시각화하고 분석하는 두 가지 방법의 유용성을 보여줍니다. 이러한 방법은 옥수수 잎 원시의 독특한 형태가 제시하는 문제에 대한 솔루션을 제공하며 옥수수 및 기타 풀 종의 잎 해부학적 및 발달 특성을 시각화하고 정량화하는 데 유용할 것입니다.

Grass crops are a major source of food and biofuel for the global population1, and improving leaf anatomy has the potential to increase their productivity2,3. However, our current understanding of how leaf anatomy is regulated in grasses is limited4 and requires the analysis of leaf primordia, as many anatomical and physiological traits of the leaf are predetermined early in development5,6,7. Cellular imaging techniques, such as fluorescence and confocal imaging, are indispensable for studying grass leaf anatomy and cellular traits, but these techniques are difficult to apply to grass leaf primordia because they are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl. We addressed this issue by developing methods for preparing transverse sections and unrolled whole-leaf mounts for fluorescence and confocal analysis of maize leaf primordia, a model system for studying grass leaf anatomy and development2,8.
The maize leaf, like all grass leaves, consists of a strap-like blade with a sheath that wraps around the stem and developing shoot9,10,11,12,13. The leaves develop from the shoot apical meristem (SAM) in a distichous pattern, where each new leaf initiates in the opposite position of the previous leaf, resulting in two ranks of leaves along the vertical axis&#160;(Figure 1A)14 . The developmental stage of each leaf primordium is identified by its position relative to the SAM, with the closest primordium designated as plastochron1 (P1) and the following primordia designated as P2, P3, and so on (Figure 1B,C)2. During development (Figure 1D), the leaf primordium first appears as a crescent-shaped buttress around the base of the SAM (P1), and then grows into a hood-shaped primordium that extends over the meristem (P2)9,10,11. The basal margins of the hood then expand laterally and overlap each other as the tip grows upward, forming a cone-shaped primordium (P3-P5)10. The primordium then rapidly grows in length, and the sheath-blade boundary at the base becomes more prominent with the formation of the ligule, the fringe-like projection on the adaxial side of the leaf (P6/P7). Finally, the leaf unrolls as it emerges from the whorl during steady-state growth, in which the dividing cells are restricted within the small basal region of the blade, forming a gradient with expanding and differentiating cells along the proximal-distal axis (P7/P8)15. The shoot apex of a maize seedling contains multiple primordia at different stages of development, making it an excellent model for studying leaf development8.
Accurate analysis of early leaf development requires staging or the use of standardized criteria to define distinct stages of primordium development in relation to other growth or morphological parameters. Because the leaf primordia are hidden within the grass shoot, investigators typically use parameters such as the age of the plant or the size of the emerging leaves as predictors for the stages and sizes of the leaf primordia9,16. In maize, the chronological age of the plant is determined either by the number of days after planting or germination (DAP/DAG)17,18. The vegetative stage (V stage) is determined by the uppermost leaf with a visible collar, a pale line on the abaxial side between the blade and the sheath that corresponds to the position of the ligule and auricles, a pair of wedge-shaped regions at the base of the blade&#160;(Figure 1A,B)17,19 . Between 20 and 25 DAG, the SAM transitions into an inflorescence meristem and ceases to produce new leaves20. The growth rates of maize leaf primordia can vary depending on the environment and the genotype of the plant. For this reason, plant age and the size of the emerging leaves cannot accurately predict the sizes of leaf primordia; however, using these parameters can help predict the range of primordia stages and sizes for experimental purposes.
Transverse section analysis is a popular method for examining leaf anatomy and development in maize and other grasses because it allows for the sampling of multiple plastochrons in a single section across the shoot21,22,23. This method is also convenient for cellular imaging of fresh samples, as the surrounding leaves serve as a scaffold&#160;that keeps the leaf primordia in place during sectioning and mounting24. However, a disadvantage of this method is that it can be challenging to precisely locate the target plastochron and region within the primordium when sectioning from an intact shoot. Furthermore, because leaf growth varies across plastochrons and along the proximal-distal axis2,5, imprecise sampling could result in an incorrect interpretation of the developmental stage and region of the primordium in a given section. Therefore, developing a method for precise transverse section sampling is critical for ensuring the accuracy and reproducibility of anatomical and developmental analyses of grass leaf primordia.
Whole-leaf mount analysis enables the comprehensive and integrative investigation of tissue and cellular processes that occur at the whole-organ scale, such as proliferative growth25 and vein patterning26,27,28. The method provides a paradermal overview of the leaf, allowing the discovery of distinct processes and patterns that would otherwise be difficult to detect using transverse section analysis24,27. Unlike in Arabidopsis, where there are already established methods for imaging whole-leaf mounts29,30, there is currently no standard method for imaging unrolled whole-leaf mounts in grasses. A previous protocol for unrolling isolated maize leaf primordia involved uncommon materials and was not suitable for cellular imaging31. Advanced imaging techniques, such as computed tomography (CT) and magnetic resonance imaging (MRI), can acquire 3D anatomical information without isolating and unrolling the primordia11,32,33, but they are expensive and require specialized equipment. Developing a technique to overcome the constraints imposed by the rolled and conical morphology of leaf primordia in maize and other grasses would advance investigations into their anatomical and developmental traits.
Here, we present methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging. We used these methods to quantify vein number and map the spatial-temporal hormone distribution in maize leaf primordia with fluorescent proteins (FPs)24. The first method involves removing the upper portion of older leaves from maize seedlings with a wire stripper (Figure 1E). By exposing the tip of the primordium (P5-P7), it becomes possible to determine its length without having to completely remove the older surrounding leaves, thus enabling easy and accurate sectioning. The second method involves unrolling and mounting whole-leaf primordia (P3-P7) with clear, double-sided nano tape (Figure 1F). These methods are suitable for visualizing various FPs24&#160;but need optimization for using fluorescent dyes and clearing reagents. In addition, we outline some procedures for flattening z-stacks, stitching images, and merging channels in ImageJ/FIJI34, which apply to the images produced by the two methods. These methods are useful for routine fluorescence or confocal imaging of maize leaves, but they can also be adapted for other model grass species, such as rice, Setaria, and Brachypodium.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig01.jpg" /> 
Figure 1: Organization and morphology of maize leaf primordia and overview of the methods. (A) Schematic representation of a maize seedling. Maize has a distichous phyllotaxy, with the new leaf initiating at the opposite position of the previous leaf. The leaf number indicates the chronological order in which the leaves emerged from germination (i.e., first leaf, L1; second leaf, L2; third leaf, L3; etc.). Each leaf has a distal blade and a basal sheath delineated by a collar that corresponds to the ligule and auricle. The uppermost leaf with the collar visible denotes the vegetative stage. The seedling in this example is at the V2 stage, with the L2 collar (arrowhead) visible. The scissors icon indicates the location at the mesocotyl (me) where the seedling must be cut in order to be collected. (B) Schematic representation of the dissected shoot showing isolated L1 to L4, with the leaf primordia L5 to L9 shown as an enlarged image in (C). The plastochron number indicates the position of the primordium relative to the SAM, with the youngest leaf primordium (P1) closest to the SAM and the older leaf primordia (P2, P3, P4, and so on) successively farther away2. (D) Schematic representation of the morphology of maize leaf primordia from P1 to P5. (E) Schematic overview of the method for transverse section analysis of the maize leaf primordia. (1) Trim the older leaves with a wire stripper. (2) Measure the primordium and section the shoot. (3) Mount the section on a slide for imaging and processing (4, 5). (F) Schematic overview of the method for whole-mount analysis of the maize leaf primordia. (1) Remove the surrounding leaves to extract the primordium. (2) Cut and unroll the primordium flat on the nano tape. (3) Mount the sample for imaging and processing (4, 5). Abbreviations: L = leaf; bl = blade; sh = sheath; co = collar; me = mesocotyl; V = vegetative; P = plastochron; SAM = shoot apical meristem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

저자 스포트라이트: 형광 및 컨포칼 이미징을 위한 옥수수 잎 Primordia의 횡절면 및 펼쳐진 전체 마운트를 준비하는 개선된 방법  

형광 및 공초점 이미징을 위해 횡단면을 준비하고 옥수수 잎 원시의 전체 마운트를 펼치기 위한 개선된 방법

Grasses like maize have leaf primordia grow within the shoot, making them difficult to study. We address this problem with improved protocols for preparing maize leaf transverse sections and whole mounts for fluorescence and confocal imaging. The first protocol uses a wire stripper to cut the older leaves, allowing the measurement of the primordium prior to sectioning.The second protocol uses clear, double-sided nano tape to unroll whole leaf primordium. These protocols improve the accuracy of transverse sectioning and enable unrolling of the leaf primordia, which have been very difficult to achieve due to their rolled, conical morphology. These methods will be useful for visualizing and quantifying leaf anatomical and developmental traits in maize and other grasses.Based on these methods, we plan to develop live cell imaging strategies to address questions in grass leaf development.

옥수수 잎 primordia의 횡단면 분석 우리는 프로토콜 섹션 2를 사용하여 정맥 수를 정량화하고 FP가 있는 옥수수 잎 원시의 횡단면에서 호르몬 반응 패턴을 특성화했습니다(그림 4)24. 잎 성장과 정맥 형성에서 식물 호르몬 옥신의 역할을 평가하기 위해 우리는 옥신 결핍 옥수수 돌연변이의 잎 원시에서 정맥의 수를 정량화하여 술을 사라지게 했습니다.254. 초기 플라스토크론에서 발달 중인 정맥은 옥수수 잎 원시의 중앙 세포층에서 뚜렷한 세포화를 나타냅니다21,22. 그러나, 종래의 조직학적 기술(22)을 사용하여 정맥을 확인하고 계수하는 것은 노동 집약적이고 시간이 많이 소요될 수 있다. 따라서, 정맥을 정량화하기 위해, 우리는 옥수수 옥신 유출 단백질 마커 p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP41(이하 PIN1a-YFP)을 활용했으며, 이는 발달 중인 정맥 및 procambial strands(PCS; 그림 4A). 프로토콜 섹션 2를 사용하여 절편 전에 원시를 측정하여 횡단면 샘플링을 표준화할 수 있었습니다(그림 4B,C). 우리는 vt2가 정상보다 더 넓은 원시와 더 많은 정맥을 갖는 경향을 발견했으며(그림 4D,E)24, 이는 완전히 확장된 잎(55)의 데이터와 일치하며, 이는 vt2의 결함이 잎 발달 초기에 시작되었음을 나타냅니다. 프로토콜 섹션 2를 사용하여 잎 원시에서 호르몬 반응 FP 리포터의 발현 패턴을 체계적으로 조사할 수 있었습니다(그림 4F-I의 이미지 예 참조). 표준화된 횡단면 샘플링 계획을 통해 우리는 다양한 플라스토크로닉과 잎 원시의 영역에 걸쳐 옥신, 사이토키닌(CK) 및 지베렐린산(GA) 반응의 분포를 매핑하고 잎 성장과 정맥 형성에 영향을 미친다는 가설을 세운 새로운 반응 패턴을 발견했습니다24. 따라서 이러한 대표적인 결과는 옥수수 잎 원시의 횡단면 분석을 위한 프로토콜 섹션 2의 유용성을 보여줍니다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig04.jpg"> 그림 4: 옥수수 잎 원시의 횡단면 분석에 대한 대표적인 결과. (AE) 옥신 유출 단백질 마커 PIN1a-YFP를 사용한 정상 및 소실 술2의 잎 원시에서 정맥 수 및 원초 너비의 정량화. (A) 발달 중인 정맥 및 procambial 가닥에서 PIN1a-YFP를 발현하는 P5 내지 P7의 횡단면의 대표적인 형광 이미지. 횡단면은 FITC 필터(495-519nm 여기)를 사용하여 에피형광 현미경으로 이미지화되었습니다. 정맥의 수와 원초 너비는 각각 FIJI/ImageJ의 다점 및 자유형 도구를 사용하여 정량화되었습니다. (B) 네 번째 잎(L4)의 끝을 노출시키기 위해 와이어 스트리퍼로 위쪽 잎 소용돌이를 제거한 옥수수 묘목. 브래킷은 투영된 원시 길이에 걸쳐 있으며 점선은 중간 길이를 나타냅니다. (C) P5에서 P7까지 다양한 원시형의 개략도로, 원시의 발달 단계에 따라 중간 길이(수평 점선)의 정맥 수와 원초 너비가 어떻게 달라질 수 있는지 보여줍니다. (D,E) 정상 및 vt2의 L4의 중간 길이 부분에서 원초 너비(D) 및 정맥 수(E)의 측정. 추세선은 측정의 10mm 이동 평균± 평균의 표준 오차(SEM)를 나타냅니다. (에프아이) PIN1a-YFP, 옥신 반응 리포터, DR5-RFP, 사이토키닌 반응 리포터, TCS-토마토, 지베렐린 산 반응 마커, GAR2-YFP 및 mDII-Venus, 옥신 신호 입력 리포터 DII-Venus의 돌연변이 버전. FP 채널은 각 이미지의 명시야 채널에 겹쳐집니다. 스케일 바 = 200 μm (A); 10mm(B); 100 μm (F-I). 이 그림은 Robil과 McSteen24의 허가를 받아 수정 및 복제되었습니다. 약어: DAG = 발아 후 일수; P = 플라스토크로닉; VT2 = 소실하는 TASSEL2; PCS = procambial strand; YFP = 황색 형광 단백질; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트; RFP = 적색 형광 단백질; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; TCS-토마토 = TCSv2::NLS-td토마토; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; mDII-금성 = pZmUbi:mDII:YFP-NLS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
옥수수 잎 primordia의 전체 마운트 분석 우리는 옥수수 잎 원시의 전체 잎 마운트에서 FP 발현을 시각화하고 분석하기 위해 프로토콜 섹션 3을 따랐습니다(그림 5). PIN1a-YFP로 정맥 패턴을 시각화함으로써 우리는 정맥의 형성이 초기 플라스토크론 동안 전체 원시에서 발생하지만 이 과정은 발달 후반에 근위 영역에서 제한된다는 것을 발견했습니다(그림 5A)24. 횡단면 분석에 보완적인 전체잎 마운트 분석은 정맥 형성 중 호르몬 반응의 조직 및 단계별 패턴을 밝혀냈다24. 한 가지 예는 PIN1a-YFP 발현에 대한 CK 응답 리포터 TCSv2::NLS-tdTomato37(TCS-Tomato)의 발현 패턴입니다(그림 5B)24. 프로토콜 섹션 3에 따라 잎 원시에서 FP 발현의 정성적 및 정량적 분석을 모두 수행할 수 있었습니다(그림 5D-F, 미공개 데이터). 우리는 옥신 반응 리포터인 DR5rev::mRFPer41(DR5-RFP) 및 GA 반응성 마커인 p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP39(GAR2-YFP)의 발현 패턴을 vt2 및 난쟁이 식물3(d3), GA 결핍 돌연변이56(그림 5D)의 단일 및 이중 돌연변이의 전체 잎 마운트에서 조사했습니다. 우리는 또한 세포 주기57에서 G1/S 전이에 대한 마커인 p Zm Cyclin-D2B::ZmCyclin-D2B:YFP 42(Cyclin-D2B-YFP)를 사용하여 정상과 vt2 잎 원시증 사이의 세포 증식의 상대적 수준을 비교했습니다(그림 5E, F). 정상과 vt2 사이에는 유의미한 차이가 없었지만, 사이클린-D2B-YFP 발현은 초기 플라스토크론31의 알려진 세포 증식 프로파일과 일치했습니다. 우리는 프로토콜 섹션 3이 롤링된 형태로 인해 이미지화하기 어려운 옥수수 잎 원시의 전체 마운트를 분석하는 효과적인 방법이라고 결론지었습니다.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig05.jpg"> 그림 5: 옥수수 잎 원시의 전체 마운트 분석에 대한 대표적인 결과. (A) 옥신 유출 단백질 마커 PIN1a-YFP로 표시된 바와 같이 발달 중인 정맥 및 procambial 가닥을 보여주는 7개 DAG 옥수수 묘목의 잎 원시의 대표적인 형광 이미지. P3-P6 원시를 베이스에서 절제하고, 펼치고, 축면이 위로 향하게 하여 평평하게 하였다. 삽입물은 P3 및 P4의 클로즈업을 보여줍니다. P5 및 P6에서 점선은 증식 영역의 말단부를 구분하며, 대부분의 procambial strands는 여전히 개발 및 확장되고 있습니다. (나,씨) P5 원시의 근위 변연 영역에서 PIN1a-YFP와 사이토키닌 반응 리포터인 TCS-Tomato의 발현을 보여주는 대표적인 공초점 이미지. (D) 소실하는 tassel2 및 난쟁이 식물3의 정상 및 단일 및 이중 돌연변이에서 옥신 반응 리포터, DR5-RFP 및 지베렐린 산 반응성 마커인 GAR2-YFP의 발현을 보여주는 P4 원시의 대표적인 형광 이미지. (E) 세포 주기에서 G1/S 전이에 대한 리포터인 Cyclin-D2B-YFP의 발현을 보여주는 P3 및/또는 P4의 대표적인 공초점 이미지. (F) ImageJ/FIJI를 사용하여 원시의 면적에 걸쳐 Cyclin-D2B-YFP 신호의 적분 밀도를 측정하여 정량화한 정상 및 vt2의 P3/P4 잎 원시에서 세포 증식의 상대적 양. 막대는 평균의 표준 오차± 평균 측정값을 나타냅니다. 스케일 바 = 500 μm (A,D,E); 200 μm (B); 100 μm (씨). 그림 4A-C는 Robil 및 McSteen24의 허가를 받아 수정 및 복제되었으며 그림 4D-F는 저자의 미공개 데이터입니다. 약어: DAG = 발아 후 일수; P = 플라스토크로닉; VT2 = 소실하는 술2; D3 = 난쟁이 식물3; YFP = 황색 형광 단백질; RFP = 적색 형광 단백질; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; TCS-토마토 = TCSv2::NLS-td토마토; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; 사이클린-D2B-YFP = p Zm 사이클린-D2B::Zm사이클린-D2B:YFP; ns = 유의한 차이 없음; au = 임의 단위. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1: 옥수수 묘목의 잎 발달 단계의 예. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239_S_File_1_Leaf_staging_maize_seedling_Fall2019%20(1).xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 S1: 프로토콜에 사용된 식물 샘플 및 재료. (ᄀ,ᄂ) 옥수수 묘목 7-8 DAG와 상단 잎 소용돌이가 와이어 스트리퍼를 사용하여 제거되었습니다. (B) 삽입물은 노출된 P6 원시가 있는 촬영의 클로즈업을 보여줍니다. (씨지) 횡단면 분석(C,D)을 위해 상부 소용돌이를 제거한 옥수수 묘목의 싹과 전체 마운트 분석(E-G)을 위해 주변 잎을 완전히 제거합니다. (H) 폴리 우레탄 겔 투명 양면 나노 테이프 롤. (나,제) P6 잎 원시(I)와 P8 잎의 근위 영역(J)을 펼치고 나노 테이프로 유리 슬라이드에 장착합니다. (K) epifluorescence 현미경의 무대에 펼쳐진 잎 원시가 있는 유리 슬라이드. 약어 : DAG = 발아 후 일수. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/S_FIGURE_1.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging at JoVE.com

옥수수 잎 primordia는 깊숙이 찢어지고 구겨져 연구하기가 어렵습니다. 여기에서 우리는 형광 및 공초점 이미징을 위해 옥수수 잎 원시의 횡단면과 펼쳐진 전체 마운트를 준비하는 방법을 제시합니다.

In maize (Zea mays) and other grasses (Poaceae), the leaf primordia are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl, making it difficult to study ...

옥수수와 같은 풀은 싹 내에서 잎이 자라기 때문에 연구하기가 어렵습니다. 우리는 형광 및 컨포칼 이미징을 위해 옥수수 잎 횡단면과 전체 마운트를 준비하기 위한 개선된 프로토콜로 이 문제를 해결합니다. 첫 번째 프로토콜은 와이어 스트리퍼를 사용하여 오래된 잎을 절단하여 절편 전에 원시를 측정할 수 있습니다.두 번째 프로토콜은 투명한 양면 나노 테이프를 사용하여 전체 잎 원시를 펼칩니다. 이러한 프로토콜은 횡단면의 정확도를 향상시키고 압연된 원뿔형 형태로 인해 달성하기가 매우 어려웠던 잎 원시의 롤링을 가능하게 합니다. 이 방법은 옥수수 및 기타 풀의 잎 해부학 적 및 발달 특성을 시각화하고 정량화하는 데 유용합니다.이러한 방법을 기반으로 우리는 잔디 잎 개발의 문제를 해결하기 위해 생세포 이미징 전략을 개발할 계획입니다.

형광 및 공초점 이미징을 위해 횡단면을 준비하고 옥수수 잎 원시의 전체 마운트를 펼치기 위한 개선된 방법

Abstract