Авторы хотели бы поблагодарить Сотрудничество в области генетики кукурузы, Проект геномики клеток кукурузы, Дэйва Джексона (Лаборатория Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк), Энн В. Сильвестр (Морская биологическая лаборатория, Чикагский университет, Иллинойс), Андреа Галлавотти (Университет Рутгерса, Нью-Джерси) и Кэролин Г. Расмуссен (Калифорнийский университет, Риверсайд) за предоставление мутантных и трансгенных запасов, а также Роберта Ф. Бейкера и Александра Юркевича из Центра усовершенствованной световой микроскопии в Университете Нью-Джерси. Миссури-Колумбия за помощь в конфокальной микроскопии. JMR был поддержан стипендией Уильяма Фулбрайта, Фондом Дианы. и Роберта Э. Шарпа и Программой исследований генома растений Национального научного фонда (IOS-1546873) для PM. CDTC, CMRV, EDCDP и RJRR поддерживаются стипендиальной программой колледжа Атенео. CDTC, EDCDP и RJRR поддерживаются стипендией бакалавриата DOST-SEI S&T. DODL поддерживается академической стипендией о. Томас Штайнбуглер SJ. RJRR поддерживается стипендией Aiducation International - Pathways to Higher Education. Эта работа была поддержана Школой науки и техники и библиотекой Рисаль Университета Атенео де Манила.

Усовершенствованные методы визуализации приморий листьев кукурузы

У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.

Мы представляем два метода подготовки зачатков листьев кукурузы к клеточной визуализации. Первый метод (раздел протокола 2) позволяет измерять зачаток для анализа поперечного сечения, в то время как второй метод (раздел протокола 3) позволяет разворачивать и сплющивать зачаток для анализа всего крепления. Эти методы облегчают клеточную визуализацию FP в зачатках листьевкукурузы 24 (как показано на рисунках 4 и 5) и обеспечивают простые решения проблем визуализации развивающихся листьев кукурузы. Секция протокола 2 сокращает время вскрытия и повышает точность отбора проб за счет измерения зачатков до секционирования, а не полагаясь исключительно на параметры постановки 9,16. С помощью коммерчески доступной наноленты раздел протокола 3 решает давнюю проблему визуализации цельнолистовых зачатков кукурузы. Этот протокол улучшает предыдущий метод, в котором использовалась диализная трубка 31, и является гораздо более дешевой альтернативой КТ и МРТ11,32,33. Однако, когда дело доходит до визуализации анатомических признаков листа и получения оптимальных результатов, оба протокола имеют некоторые ограничения, которые изложены в таблице 2 и более подробно обсуждаются ниже.
В разделе протокола 2 мы столкнулись с трудностями визуализации контуров клеток в толстых поперечных срезах зачатков листьев, а контрокрашивание флуоресцентными красителями, связывающими клеточную стенку или плазматическую мембрану, не дало удовлетворительных результатов. Например, FM 4-64 дал субоптимальные результаты по сравнению с маркером FP плазматической мембраны, p Zm PIP2-1::ZmPIP2-1:CFP39 (PIP2-1-CFP; Рисунок 3А-Г). Чтобы преодолеть это ограничение, мы рекомендуем использовать вибратому для получения более тонких срезов ткани (~0,1 мм)58, что позволит получить яркую визуализацию очертаний клеток в ярком поле или оптимизировать протокол контрокрашивания47,59.
В разделе 3 протокола основным ограничением является сложность монтажа створки без разрыва, повреждения или пузырьков воздуха, как подробно описано в этапах протокола 3.2.5-3.2.6 (рис. 3E-K). Поскольку лист кукурузы является двусторонне симметричным, для визуализации9 может быть достаточно полулистового крепления, а не цельнолистового. Для этого зачаток можно разрезать лезвием бритвы вдоль продольной оси, предварительно развернув его до средней жилки, позволив смонтировать только половину листа. Еще одно ограничение раздела протокола 3 заключается в том, что толщина листа может ограничивать оптическое разрешение сигнала флуорофора во время глубокой визуализации. Для решения этой проблемы можно использовать технику очистки тканей60. Однако мы обнаружили, что ClearSee61, широко используемый очищающий реагент для визуализации тканей растений, несовместим с протоколом, поскольку он вызывает отделение образца и покровного стекла от наноленты. Потенциальным решением этой проблемы может быть нанесение полупроницаемой мембраны31 на образец листа, позволяющей обрабатывать его очищающим раствором, удерживая его на месте нанолентой. Такой метод, позволяющий наносить жидкие растворы на развернутый лист, может также быть использован для методов гибридизации и иммунолокализации цельной РНК in situ, которые ранее были оптимизированы для развития соцветий кукурузы, но не для цельнолистовых зачатков62,63.
Мы описали протоколы для кукурузы, которая имеет крупнолистные зачатки даже на стадии рассады. Другие виды трав с гораздо меньшими зачатками листьев, такие как рис, ячмень, пшеница, сетария и Brachypodium 16,23,64,65,66, могут потребовать использования дополнительных прецизионных инструментов для эффективного применения этих протоколов. Кроме того, эти протоколы не предназначались для визуализации живых клеток, которая фиксирует динамические процессы формирования тканей и клеточных реакций в режиме реального времени. Однако по мере того, как флуоресцентные зонды, технологии визуализации и вычислительные возможности продолжают развиваться в области визуализации живых клеток для растений67, будущие исследования могут основываться на этих протоколах для разработки стратегий визуализации живых клеток, адаптированных к уникальным особенностям зачатков листьев травы.

Травяные культуры являются основным источником продовольствия и биотопливадля населения планеты1, и улучшение анатомии листьев может повысить их продуктивность 2,3. Однако наше нынешнее понимание того, как регулируется анатомия листьев у трав, ограничено4 и требует анализа зачатков листьев, поскольку многие анатомические и физиологические особенности листа предопределены на ранних стадиях развития 5,6,7. Методы клеточной визуализации, такие как флуоресцентная и конфокальная визуализация, необходимы для изучения анатомии листьев травы и клеточных признаков, но эти методы трудно применить к зачаткам листьев травы, потому что они глубоко покрыты и свернуты внутри мутовки листа. Мы решили этот вопрос, разработав методы подготовки поперечных срезов и развернутых цельнолистовых креплений для флуоресцентного и конфокального анализа зачатков листьев кукурузы, модельную систему для изучения анатомии и развития листьев травы 2,8.
Лист кукурузы, как и все листья травы, состоит из ремешкообразной лопасти с оболочкой, которая оборачивается вокруг стебля и развивающегося побега 9,10,11,12,13. Листья развиваются из апикальной меристемы побега (SAM) по дистихозному рисунку, где каждый новый лист начинается в положении, противоположном предыдущему листу, в результате чего вдоль вертикальной оси образуются два ряда листьев (рис. 1A)14. Стадия развития каждого листового зачатка определяется его положением относительно SAM, при этом ближайший примордиум обозначается как пластохрон1 (P1), а следующие зачатки обозначаются как P2, P3 и т. д. (рис. 1B, C)2. Во время развития (рис. 1D) зачаток листа сначала появляется в виде контрфорса в форме полумесяца вокруг основания SAM (P1), а затем вырастает в примордиум в форме капюшона, который простирается над меристемой (P2)9,10,11. Затем базальные края капюшона расширяются латерально и перекрывают друг друга по мере роста кончика вверх, образуя конусообразный зачаток (P3-P5)10. Затем зачаток быстро увеличивается в длину, и граница влагалища и лопасти у основания становится более заметной с образованием лигулы, бахромчатого выступа на адаксиальной стороне листа (P6 / P7). Наконец, лист разворачивается, когда он выходит из мутовки во время стационарного роста, при котором делящиеся клетки ограничены в небольшой базальной области лопасти, образуя градиент с расширяющимися и дифференцирующимися клетками вдоль проксимально-дистальной оси (P7 / P8)15. Верхушка побега сеянца кукурузы содержит несколько зачатков на разных стадиях развития, что делает ее отличной моделью для изучения развития листьев8.
Точный анализ раннего развития листьев требует постановки или использования стандартизированных критериев для определения отдельных стадий развития зачатка по отношению к другим ростовым или морфологическим параметрам. Поскольку зачатки листьев скрыты внутри побега травы, исследователи обычно используют такие параметры, как возраст растения или размер появляющихся листьев, в качестве предикторов стадий и размеров зачатков листьев 9,16. У кукурузы хронологический возраст растения определяется либо количеством дней после посадки, либо прорастанием (DAP/DAG)17,18. Вегетативная стадия (V стадия) определяется самым верхним листом с видимым воротником, бледной линией на абаксиальной стороне между лопастью и влагалищем, соответствующей положению лигулы и ушных раковин, парой клиновидных областей у основания лопасти (рис. 1А,Б)17,19. Между 20 и 25 DAG SAM переходит в меристему соцветия и перестает давать новые листья20. Темпы роста зачатков листьев кукурузы могут варьироваться в зависимости от окружающей среды и генотипа растения. По этой причине возраст растения и размер появляющихся листьев не могут точно предсказать размеры листовых зачатков; Однако использование этих параметров может помочь предсказать диапазон стадий и размеров зачатков для экспериментальных целей.
Анализ поперечного среза является популярным методом изучения анатомии и развития листьев кукурузы и других трав, поскольку он позволяет отбирать образцы нескольких пластохронов в одном срезе побега21,22,23. Этот метод также удобен для клеточной визуализации свежих образцов, так как окружающие листья служат каркасом, который удерживает зачатки листьев на месте во время секционирования и монтажа24. Однако недостатком этого метода является то, что может быть сложно точно определить местоположение целевого пластохрона и области в зачатке при разделении неповрежденного побега. Кроме того, поскольку рост листьев различается по пластохронам и вдоль проксимально-дистальной оси2,5, неточный отбор проб может привести к неправильной интерпретации стадии развития и области зачатка в данном срезе. Таким образом, разработка метода точного отбора проб поперечного сечения имеет решающее значение для обеспечения точности и воспроизводимости анатомических анализов и анализов развития зачатков листьев травы.
Анализ цельного листа позволяет всесторонне и комплексно исследовать тканевые и клеточные процессы, происходящие в масштабе всего органа, такие как пролиферативный рост25 и рисунок вен26,27,28. Метод обеспечивает парадермальный обзор листа, позволяя обнаруживать различные отростки и закономерности, которые в противном случае было бы трудно обнаружить с помощью анализа поперечного сечения24,27. В отличие от Arabidopsis, где уже существуют установленные методы визуализации цельнолистовых креплений29,30, в настоящее время не существует стандартного метода визуализации развернутых цельнолистовых креплений в травах. Предыдущий протокол для развертывания изолированных зачатков листьев кукурузы включал необычные материалы и не подходил для клеточной визуализации31. Передовые методы визуализации, такие как компьютерная томография (КТ) и магнитно-резонансная томография (МРТ), позволяют получать 3D-анатомическую информацию без выделения и развертывания зачатков 11,32,33, но они дороги и требуют специализированного оборудования. Разработка метода преодоления ограничений, налагаемых свернутой и конической морфологией зачатков листьев кукурузы и других трав, будет способствовать исследованиям их анатомических особенностей и особенностей развития.
Здесь мы представляем методы подготовки поперечных срезов и развернутых целых креплений зачатков листьев кукурузы для флуоресцентной и конфокальной визуализации. Мы использовали эти методы для количественной оценки количества вен и картирования пространственно-временного распределения гормонов в зачатках листьев кукурузы с флуоресцентными белками (FP)24. Первый способ заключается в удалении верхней части старых листьев с рассады кукурузы с помощью проволочной зачистки (рис. 1E). Обнажая кончик зачатка (P5-P7), становится возможным определить его длину без необходимости полностью удалять более старые окружающие листья, что позволяет легко и точно срезать. Второй способ включает в себя разматывание и монтаж цельнолистовых зачатков (P3-P7) с помощью прозрачной двусторонней наноленты (рис. 1F). Эти методы подходят для визуализации различных FP24, но нуждаются в оптимизации для использования флуоресцентных красителей и очищающих реагентов. Кроме того, мы описываем некоторые процедуры сглаживания z-стеков, сшивания изображений и объединения каналов в ImageJ/FIJI34, которые применяются к изображениям, созданным двумя методами. Эти методы полезны для рутинной флуоресценции или конфокальной визуализации листьев кукурузы, но они также могут быть адаптированы для других модельных видов трав, таких как рис, сетария и брахиподиум.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig01.jpg"> Рисунок 1: Организация и морфология зачатков листьев кукурузы и обзор методов . (А) Схематическое изображение саженца кукурузы. Кукуруза имеет дистихузную филлотаксию, при этом новый лист начинается в положении, противоположном предыдущему листу. Номер листа указывает на хронологический порядок, в котором листья появились в результате прорастания (т. е. первый лист, L1; второй лист, L2; третий лист, L3; и т. д.). Каждый лист имеет дистальную лопасть и базальную оболочку, очерченную воротником, который соответствует язычку и ушной раковине. Самый верхний лист с видимым воротником обозначает вегетативную стадию. Саженец в этом примере находится на стадии V2, с видимым воротником L2 (наконечником стрелки). Значок ножниц указывает на место в мезокотиле (me), где саженец должен быть срезан, чтобы его можно было собрать. (B) Схематическое изображение рассеченного побега, показывающего изолированные L1 - L4, с зачатками листьев от L5 до L9, показанными в виде увеличенного изображения в (C). Номер пластохрона указывает положение зачатка относительно SAM, при этом самый молодой зачаток листа (P1) находится ближе всего к SAM, а более старые зачатки листа (P2, P3, P4 и т. д.) последовательно находятся дальше2. (D) Схематическое изображение морфологии зачатков листьев кукурузы от P1 до P5. е) Схематический обзор метода анализа поперечного сечения зачатков листьев кукурузы. (1) Обрежьте старые листья с помощью проволочной зачистки. (2) Измерьте зародыш и разделите побег. (3) Закрепите секцию на предметном стекле для визуализации и обработки (4, 5). F) Схематический обзор метода анализа зачатков листьев кукурузы по всей маине. (1) Удалите окружающие листья, чтобы извлечь зачаток. (2) Разрежьте и разверните завичок на наноленте. (3) Смонтируйте образец для визуализации и обработки (4, 5). Сокращения: L = лист; bl = лезвие; sh = оболочка; СО = воротник; me = мезокотил; V = вегетативный; P = пластохрон; SAM = побег апикальной меристемы. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylic Gel Clear Double Sided Nano Tape 16.5 ft x 1.2 in, 2 mm thick</td>
			<td>EZlifego Store (Amazon)</td>
			<td>B07YB1ZXG6</td>
			<td>1 roll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bellucci Pick Curved micro probe 16.8 cm, 6.6 in</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>N1692 9</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clayman guide microprobe Sinskey hook angled shaft, 11.6 cm, 4.6 in</td>
			<td>Storz Opthalmic Instruments</td>
			<td>E0542</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Probe, Bent Needle, 14 cm (5.5 in)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>13553</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWELL 10-22 AWG Wire Stripper</td>
			<td>Dowell Store (Amazon)</td>
			<td>10-22 AWG</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Double Edge Carbon Steel Blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-9</td>
			<td>pkg/10; for fine sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted End Glass Microscope Slides, 75 mm x 25 mm x 1-1.2 mm</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260442</td>
			<td>pkg/144</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEM Single Edge, Stainless Steel Uncoated Blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-1</td>
			<td>box/200; for general cutting/sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI17904</td>
			<td>1 liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FIJI with EDF plugin (version 17.05.2021) and Grid/Collection Stitching plugin</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH) USA</td>
			<td>version 2.9.0/1.54s</td>
			<td>The EDF plugin was developed by Alex Prudencio, Jesse Berent, and Daniel Sage for the Biomedical Imaging Group, &#201;cole Polytechnique F&#233;d&#233;rale de Lausanne (EPFL; http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/). The grid/collection stitching software was developed by Stephan Preibisch for the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Ex-L Small 111.76 mm x 213.36 mm</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>34155</td>
			<td>box/280 ply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, 22 mm x 22 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260140</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PU Gel Clear Double Sided Nano Tape 29.5 ft x 1.18 in, 1 mm thick</td>
			<td>Yecaye Store (Amazon)</td>
			<td>L354 W1.18</td>
			<td>2 rolls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superslip Cover Glasses, 24 mm x 50 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260166</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superslip Cover Glasses, 24 mm x 60 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260168</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempered Glass Cutting Board</td>
			<td>Hacaroa (Amazon)</td>
			<td>B09XMXBT5S</td>
			<td>4 pc</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging

У кукурузы (Zea mays) и других трав (Poaceae) зачатки листьев глубоко покрыты и свернуты в мутовку листа, что затрудняет изучение раннего развития листьев. Здесь мы описываем методы подготовки поперечных срезов и развернутых целых креплений зачатков листьев кукурузы для флуоресцентной и конфокальной визуализации. В первом методе используется проволочный стриппер для удаления верхних частей старых листьев, обнажая кончик зачатка листа и позволяя измерять его для более точного отбора проб поперечного сечения. Во втором методе используется прозрачная двусторонняя нанолента для развёртывания и крепления цельнолистовых зачатков для визуализации. Мы показываем полезность этих двух методов в визуализации и анализе репортеров флуоресцентных белков в кукурузе. Эти методы обеспечивают решение проблем, связанных с отличительной морфологией зачатков листьев кукурузы, и будут полезны для визуализации и количественной оценки анатомических признаков и особенностей развития листьев у кукурузы и других видов трав.

Grass crops are a major source of food and biofuel for the global population1, and improving leaf anatomy has the potential to increase their productivity2,3. However, our current understanding of how leaf anatomy is regulated in grasses is limited4 and requires the analysis of leaf primordia, as many anatomical and physiological traits of the leaf are predetermined early in development5,6,7. Cellular imaging techniques, such as fluorescence and confocal imaging, are indispensable for studying grass leaf anatomy and cellular traits, but these techniques are difficult to apply to grass leaf primordia because they are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl. We addressed this issue by developing methods for preparing transverse sections and unrolled whole-leaf mounts for fluorescence and confocal analysis of maize leaf primordia, a model system for studying grass leaf anatomy and development2,8.
The maize leaf, like all grass leaves, consists of a strap-like blade with a sheath that wraps around the stem and developing shoot9,10,11,12,13. The leaves develop from the shoot apical meristem (SAM) in a distichous pattern, where each new leaf initiates in the opposite position of the previous leaf, resulting in two ranks of leaves along the vertical axis&#160;(Figure 1A)14 . The developmental stage of each leaf primordium is identified by its position relative to the SAM, with the closest primordium designated as plastochron1 (P1) and the following primordia designated as P2, P3, and so on (Figure 1B,C)2. During development (Figure 1D), the leaf primordium first appears as a crescent-shaped buttress around the base of the SAM (P1), and then grows into a hood-shaped primordium that extends over the meristem (P2)9,10,11. The basal margins of the hood then expand laterally and overlap each other as the tip grows upward, forming a cone-shaped primordium (P3-P5)10. The primordium then rapidly grows in length, and the sheath-blade boundary at the base becomes more prominent with the formation of the ligule, the fringe-like projection on the adaxial side of the leaf (P6/P7). Finally, the leaf unrolls as it emerges from the whorl during steady-state growth, in which the dividing cells are restricted within the small basal region of the blade, forming a gradient with expanding and differentiating cells along the proximal-distal axis (P7/P8)15. The shoot apex of a maize seedling contains multiple primordia at different stages of development, making it an excellent model for studying leaf development8.
Accurate analysis of early leaf development requires staging or the use of standardized criteria to define distinct stages of primordium development in relation to other growth or morphological parameters. Because the leaf primordia are hidden within the grass shoot, investigators typically use parameters such as the age of the plant or the size of the emerging leaves as predictors for the stages and sizes of the leaf primordia9,16. In maize, the chronological age of the plant is determined either by the number of days after planting or germination (DAP/DAG)17,18. The vegetative stage (V stage) is determined by the uppermost leaf with a visible collar, a pale line on the abaxial side between the blade and the sheath that corresponds to the position of the ligule and auricles, a pair of wedge-shaped regions at the base of the blade&#160;(Figure 1A,B)17,19 . Between 20 and 25 DAG, the SAM transitions into an inflorescence meristem and ceases to produce new leaves20. The growth rates of maize leaf primordia can vary depending on the environment and the genotype of the plant. For this reason, plant age and the size of the emerging leaves cannot accurately predict the sizes of leaf primordia; however, using these parameters can help predict the range of primordia stages and sizes for experimental purposes.
Transverse section analysis is a popular method for examining leaf anatomy and development in maize and other grasses because it allows for the sampling of multiple plastochrons in a single section across the shoot21,22,23. This method is also convenient for cellular imaging of fresh samples, as the surrounding leaves serve as a scaffold&#160;that keeps the leaf primordia in place during sectioning and mounting24. However, a disadvantage of this method is that it can be challenging to precisely locate the target plastochron and region within the primordium when sectioning from an intact shoot. Furthermore, because leaf growth varies across plastochrons and along the proximal-distal axis2,5, imprecise sampling could result in an incorrect interpretation of the developmental stage and region of the primordium in a given section. Therefore, developing a method for precise transverse section sampling is critical for ensuring the accuracy and reproducibility of anatomical and developmental analyses of grass leaf primordia.
Whole-leaf mount analysis enables the comprehensive and integrative investigation of tissue and cellular processes that occur at the whole-organ scale, such as proliferative growth25 and vein patterning26,27,28. The method provides a paradermal overview of the leaf, allowing the discovery of distinct processes and patterns that would otherwise be difficult to detect using transverse section analysis24,27. Unlike in Arabidopsis, where there are already established methods for imaging whole-leaf mounts29,30, there is currently no standard method for imaging unrolled whole-leaf mounts in grasses. A previous protocol for unrolling isolated maize leaf primordia involved uncommon materials and was not suitable for cellular imaging31. Advanced imaging techniques, such as computed tomography (CT) and magnetic resonance imaging (MRI), can acquire 3D anatomical information without isolating and unrolling the primordia11,32,33, but they are expensive and require specialized equipment. Developing a technique to overcome the constraints imposed by the rolled and conical morphology of leaf primordia in maize and other grasses would advance investigations into their anatomical and developmental traits.
Here, we present methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging. We used these methods to quantify vein number and map the spatial-temporal hormone distribution in maize leaf primordia with fluorescent proteins (FPs)24. The first method involves removing the upper portion of older leaves from maize seedlings with a wire stripper (Figure 1E). By exposing the tip of the primordium (P5-P7), it becomes possible to determine its length without having to completely remove the older surrounding leaves, thus enabling easy and accurate sectioning. The second method involves unrolling and mounting whole-leaf primordia (P3-P7) with clear, double-sided nano tape (Figure 1F). These methods are suitable for visualizing various FPs24&#160;but need optimization for using fluorescent dyes and clearing reagents. In addition, we outline some procedures for flattening z-stacks, stitching images, and merging channels in ImageJ/FIJI34, which apply to the images produced by the two methods. These methods are useful for routine fluorescence or confocal imaging of maize leaves, but they can also be adapted for other model grass species, such as rice, Setaria, and Brachypodium.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig01.jpg" /> 
Figure 1: Organization and morphology of maize leaf primordia and overview of the methods. (A) Schematic representation of a maize seedling. Maize has a distichous phyllotaxy, with the new leaf initiating at the opposite position of the previous leaf. The leaf number indicates the chronological order in which the leaves emerged from germination (i.e., first leaf, L1; second leaf, L2; third leaf, L3; etc.). Each leaf has a distal blade and a basal sheath delineated by a collar that corresponds to the ligule and auricle. The uppermost leaf with the collar visible denotes the vegetative stage. The seedling in this example is at the V2 stage, with the L2 collar (arrowhead) visible. The scissors icon indicates the location at the mesocotyl (me) where the seedling must be cut in order to be collected. (B) Schematic representation of the dissected shoot showing isolated L1 to L4, with the leaf primordia L5 to L9 shown as an enlarged image in (C). The plastochron number indicates the position of the primordium relative to the SAM, with the youngest leaf primordium (P1) closest to the SAM and the older leaf primordia (P2, P3, P4, and so on) successively farther away2. (D) Schematic representation of the morphology of maize leaf primordia from P1 to P5. (E) Schematic overview of the method for transverse section analysis of the maize leaf primordia. (1) Trim the older leaves with a wire stripper. (2) Measure the primordium and section the shoot. (3) Mount the section on a slide for imaging and processing (4, 5). (F) Schematic overview of the method for whole-mount analysis of the maize leaf primordia. (1) Remove the surrounding leaves to extract the primordium. (2) Cut and unroll the primordium flat on the nano tape. (3) Mount the sample for imaging and processing (4, 5). Abbreviations: L = leaf; bl = blade; sh = sheath; co = collar; me = mesocotyl; V = vegetative; P = plastochron; SAM = shoot apical meristem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

В центре внимания автора: Усовершенствованные методы подготовки поперечных срезов и развернутых целых гор примордий листьев кукурузы для флуоресцентной и конфокальной визуализации  

Усовершенствованные методы подготовки поперечных срезов и развернутых цельных креплений примордий листьев кукурузы для флуоресцентной и конфокальной визуализации

Grasses like maize have leaf primordia grow within the shoot, making them difficult to study. We address this problem with improved protocols for preparing maize leaf transverse sections and whole mounts for fluorescence and confocal imaging. The first protocol uses a wire stripper to cut the older leaves, allowing the measurement of the primordium prior to sectioning.The second protocol uses clear, double-sided nano tape to unroll whole leaf primordium. These protocols improve the accuracy of transverse sectioning and enable unrolling of the leaf primordia, which have been very difficult to achieve due to their rolled, conical morphology. These methods will be useful for visualizing and quantifying leaf anatomical and developmental traits in maize and other grasses.Based on these methods, we plan to develop live cell imaging strategies to address questions in grass leaf development.

Анализ поперечных срезов зачатков листьев кукурузы Мы использовали раздел протокола 2 для количественной оценки количества вен и характеристики паттернов гормонального ответа в поперечных срезах зачатков листьев кукурузы с FP (рис. 4)24. Чтобы оценить роль растительного гормона ауксина в росте листьев и образовании жилок, мы количественно определили количество жилок в зачатках листьев мутанта кукурузы, дефицитного ауксина, исчезающей кисточки254. У ранних пластохронов развивающиеся жилки демонстрируют отчетливую клеточность в срединном клеточном слое зачатка листьев кукурузы21,22. Однако идентификация и подсчет вен с использованием обычных гистологических методов22 может быть трудоемким и длительным. Таким образом, для количественной оценки вен мы использовали белковый маркер оттока ауксина кукурузы p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP41 (далее PIN1a-YFP), который отмечает развивающиеся вены и прокамбиальные нити (PCS; Рисунок 4А). Используя секцию протокола 2, мы смогли стандартизировать отбор проб поперечного сечения, измерив зачатки перед секционированием (рис. 4B, C). Мы обнаружили тенденцию, при которой vt2 имеет более широкий зачаток и больше жилок, чем обычно (рис. 4D, E)24, что согласуется с данными по полностью расширенным листьям55, что указывает на то, что дефект vt2 начался на ранних стадиях развития листьев. Используя раздел протокола 2, мы также смогли систематически исследовать паттерны экспрессии репортеров FP гормонального ответа в зачатках листьев (см. примеры изображений на рисунке 4F-I). С помощью стандартизированной схемы отбора проб поперечного сечения мы нанесли на карту распределение ответов ауксина, цитокинина (CK) и гибберелловой кислоты (GA) по различным пластохронам и областям зачатков листьев и обнаружили новые паттерны ответа, которые, как мы предполагаем, имеют значение для роста листьев и образования вен24. Таким образом, эти репрезентативные результаты демонстрируют полезность раздела протокола 2 для анализа поперечных срезов зачатков листьев кукурузы.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig04.jpg"> Рисунок 4: Репрезентативные результаты анализа поперечного сечения зачатков листьев кукурузы. (A-E) Количественная оценка количества жилок и ширины зачатков в зачатках листьев нормальной и исчезающей кисточки2 с маркером белка оттока ауксина PIN1a-YFP. (A) Репрезентативные флуоресцентные изображения поперечных срезов от P5 до P7, экспрессирующих PIN1a-YFP в развивающихся венах и прокамбиальных нитях. Поперечные срезы визуализировали с помощью эпифлуоресцентного микроскопа с использованием фильтра FITC (возбуждение 495-519 нм). Количество жилок и ширина зачатка были количественно определены с использованием многоточечных и произвольных линейных инструментов в FIJI/ImageJ, соответственно. (B) Саженец кукурузы с верхними завитками листьев, удаленными с помощью проволочной зачистки для обнажения кончика четвертого листа (L4). Кронштейн охватывает проецируемую длину зачатка, а пунктирная линия указывает на среднюю длину. (C) Принципиальная диаграмма различных форм зачатка от P5 до P7, иллюстрирующая, как количество жилок и ширина зачатка на средней длине (горизонтальная пунктирная линия) могут варьироваться в зависимости от стадии развития зачатка. (Д,Е) Измерение ширины зачатка (D) и числа жилок (E) в средней длине участка L4 нормы и vt2. Линия тренда представляет собой скользящие средние измерений 10 мм ± стандартной погрешности среднего значения (SEM). (Ф-И) Репрезентативные конфокальные изображения поперечных срезов зачатков листьев, экспрессирующих комбинации PIN1a-YFP, репортера ауксинового ответа, DR5-RFP, репортера цитокининового ответа, TCS-Tomato, маркера, чувствительного к гибберелловой кислоте, GAR2-YFP и mDII-Venus, мутировавшей версии репортера сигнального сигнала ауксина DII-Venus. Каналы FP накладываются на канал светлого поля на каждом изображении. Масштабная линейка = 200 мкм (А); 10 мм (В); 100 мкм (F-I). Этот рисунок был изменен и воспроизведен с разрешения Робиля и МакСтина24. Сокращения: DAG = дни после появления всходов; P = пластохрон; VT2 = исчезающая кисточка2; PCS = прокамбиальная прядь; YFP = желтый флуоресцентный белок; FITC = изотиоцианат флуоресцеина; RFP = красный флуоресцентный белок; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; TCS-Tomato = TCSv2::NLS-tdTomato; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; mDII-Венера = pZmUbi:mDII:YFP-NLS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Цельный анализ зачатков листьев кукурузы Мы следовали разделу протокола 3 для визуализации и анализа экспрессии FP в цельнолистовых креплениях зачатков листьев кукурузы (рис. 5). Визуализируя паттерны вен с помощью PIN1a-YFP, мы обнаружили, что образование вен происходит во всем зачатке во время ранних пластохронов, но этот процесс становится ограниченным в проксимальных областях на более поздних стадиях развития (рис. 5A)24. В дополнение к анализу поперечного среза, анализ цельного листа выявил тканеспецифические и стадийные паттерны гормонального ответа во время образования вен24. Одним из примеров является паттерн экспрессии репортера ответа CK TCSv2::NLS-tdTomato37 (TCS-Tomato) относительно экспрессии PIN1a-YFP (рис. 5B)24. Следуя разделу 3 протокола, мы смогли провести как качественный, так и количественный анализ экспрессии FP в зачатках листьев (рис. 5D-F; неопубликованные данные). Мы изучили паттерны экспрессии репортера отклика ауксина, DR5rev::mRFPer41 (DR5-RFP), и GA-чувствительного маркера, p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP39 (GAR2-YFP), в цельнолистовых креплениях одиночных и двойныхмутантов vt2 и карликового растения3 (d3), мутанта56 с дефицитом GA. Мы также сравнили относительные уровни клеточной пролиферации между нормальными и vt2 листовыми зачатками с использованием pZmCyclin-D2B::ZmCyclin-D2B:YFP42 (Cyclin-D2B-YFP), который является маркером перехода G1/S в клеточном цикле57 (рис. 5E, F). Хотя не было существенной разницы между нормальным и vt2, экспрессия Cyclin-D2B-YFP согласовывалась с известным профилем пролиферации клеток ранних пластохронов31. Мы пришли к выводу, что секция протокола 3 является эффективным методом анализа целых массивов зачатков листьев кукурузы, которые трудно визуализировать из-за их свернутой морфологии.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig05.jpg"> Рисунок 5: Репрезентативные результаты анализа зачатков листьев кукурузы по всей мане. (A) Репрезентативные флуоресцентные изображения зачатков листьев 7 проростков кукурузы DAG, показывающие развивающиеся жилки и прокамбиальные нити, отмеченные маркером белка оттока ауксина PIN1a-YFP. Зачатки Р3-Р6 вырезали из основания, разворачивали и уплощали адаксиальной стороной вверх. На врезках показаны крупные планы P3 и P4. В P5 и P6 пунктирные линии разграничивают дистальный конец пролиферативных зон, где большинство прокамбиальных нитей все еще развиваются и расширяются. (В,В) Репрезентативные конфокальные изображения, показывающие экспрессию PIN1a-YFP и репортера цитокинина, TCS-Tomato, в проксимальной краевой области зачатка P5. (D) Репрезентативные флуоресцентные изображения зачатков P4, показывающие экспрессию репортера ауксинового ответа, DR5-RFP и маркера, чувствительного к гибберелловой кислоте, GAR2-YFP у нормальных, одиночных и двойных мутантов исчезающей кисточки2 и карликового растения3. (E) Репрезентативные конфокальные изображения P3 и/или P4, показывающие экспрессию Cyclin-D2B-YFP, репортера перехода G1/S в клеточном цикле. (F) Относительные количества клеточной пролиферации в зачатках листьев P3/P4 в норме и vt2, количественно определяемые путем измерения интегральной плотности сигнала Cyclin-D2B-YFP по площади зачатка с использованием ImageJ/FIJI. Столбцы представляют средние измерения ± стандартную погрешность среднего значения. Линейка шкалы = 500 мкм (A, D, E); 200 мкм (В); 100 мкм (С). Рисунок 4A-C был изменен и воспроизведен с разрешения Робиля и Макстина24, в то время как рисунок 4D-F является неопубликованными данными авторов. Сокращения: DAG = дни после появления всходов; P = пластохрон; VT2 = исчезающая кисточка2; d3 = карликовое растение3; YFP = желтый флуоресцентный белок; RFP = красный флуоресцентный белок; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; TCS-Tomato = TCSv2::NLS-tdTomato; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; Циклин-D2B-YFP = pZmЦиклин-D2B::ZmЦиклин-D2B:YFP; ns = нет существенной разницы; au = произвольная единица. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Дополнительный файл 1: Примеры стадий развития листьев у проростков кукурузы. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239_S_File_1_Leaf_staging_maize_seedling_Fall2019%20(1).xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>
Дополнительный рисунок S1: Образцы растений и материалы, используемые в протоколах. (А,Б) Рассада кукурузы 7-8 DAG с верхней листовой мутовкой удаляется с помощью проволочного стриппера. (B) На врезке показан крупный план съемки с экспонированным зачатком P6. (К-Г) Всходы проростков кукурузы с удаленными верхними мутовками для анализа поперечного сечения (C, D) и окружающими листьями полностью удаленными для анализа всей горы (E-G). (H) Рулон полиуретановой гелевой прозрачной двусторонней наноленты. (И,Ж) Зачаток листа P6 (I) и проксимальная область листа P8 (J) разворачиваются и устанавливаются на предметные стекла с помощью наноленты. (K) Предметное стекло с развернутым зачатком листа, установленное на столике эпифлуоресцентного микроскопа. Аббревиатура: DAG = дни после появления всходов. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/S_FIGURE_1.pdf" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging at JoVE.com

Зачатки листьев кукурузы глубоко покрыты и свернуты, что затрудняет их изучение. Здесь мы представляем методы подготовки поперечных срезов и развернутых целых креплений зачатков листьев кукурузы для флуоресцентной и конфокальной визуализации.

In maize (Zea mays) and other grasses (Poaceae), the leaf primordia are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl, making it difficult to study ...

У таких трав, как кукуруза, зачатки листьев растут внутри побега, что затрудняет их изучение. Мы решаем эту проблему с помощью улучшенных протоколов подготовки поперечных срезов листьев кукурузы и целых креплений для флуоресцентной и конфокальной визуализации. В первом протоколе используется проволочный стриппер для срезания старых листьев, что позволяет измерить зачаток до разделения.Во втором протоколе используется прозрачная двусторонняя нанолента для развёртывания целого листа зачатка. Эти протоколы повышают точность поперечного сечения и позволяют разворачивать зачатки листьев, чего было очень трудно достичь из-за их свернутой конической морфологии. Эти методы будут полезны для визуализации и количественной оценки анатомических признаков листьев и признаков развития кукурузы и других трав.Основываясь на этих методах, мы планируем разработать стратегии визуализации живых клеток для решения вопросов развития листьев травы.

Abstract