Verbeterde lipofuscinemodellen en kwantificering van de fagocytosecapaciteit van het buitenste segment in sterk gepolariseerde menselijke retinale pigmentepitheelculturen

De dagelijkse fagocytose van fotoreceptor buitenste segmenten door het retinale pigmentepitheel (RPE) draagt bij aan de accumulatie van een intracellulair verouderingspigment genaamd lipofuscine. De toxiciteit van lipofuscine is goed ingeburgerd bij de ziekte van Stargardt, de meest voorkomende erfelijke retinale degeneratie, maar is meer controversieel bij leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), de belangrijkste oorzaak van onomkeerbare blindheid in de ontwikkelde wereld. Het bepalen van lipofuscine toxiciteit bij mensen is moeilijk geweest, en diermodellen van Stargardt's hebben beperkte toxiciteit. In vitro modellen die menselijke RPE in vivo nabootsen, zijn dus nodig om de generatie, klaring en toxiciteit van lipofuscine beter te begrijpen. De meeste celkweek-lipofuscinemodellen tot nu toe waren in cellijnen of hadden betrekking op het voeden van RPE met een enkel onderdeel van het complexe lipofuscinemengsel in plaats van fragmenten / tips van het hele buitenste segment van de fotoreceptor, wat een completer en fysiologischer lipofuscinemodel genereert. Hier wordt een methode beschreven om de accumulatie van lipofuscine-achtig materiaal (onverteerbaar autofluorescentiemateriaal of UAM genoemd) te induceren in sterk gedifferentieerde primaire menselijke prenatale RPE (hfRPE) en geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) afgeleide RPE. UAM geaccumuleerd in culturen door herhaalde voedingen van met ultraviolet licht behandelde OS-fragmenten die door de RPE via fagocytose worden opgenomen. De belangrijkste manieren waarop UAM in vivo lipofuscine benadert en verschilt, worden ook besproken. Bij dit model van lipofuscine-achtige accumulatie worden beeldvormingsmethoden geïntroduceerd om het brede autofluorescentiespectrum van UAM-korrels te onderscheiden van gelijktijdige antilichaamkleuring. Ten slotte is, om de impact van UAM op de RPE-fagocytosecapaciteit te beoordelen, een nieuwe methode geïntroduceerd voor het kwantificeren van de opname en afbraak van fragmenten in het buitenste segment/tips. Deze methode, die "Total Consumptive Capacity" wordt genoemd, overwint mogelijke verkeerde interpretaties van RPE-fagocytosecapaciteit die inherent zijn aan klassieke "pulse-chase" -testen in het buitenste segment. De hier geïntroduceerde modellen en technieken kunnen worden gebruikt om lipofuscinegeneratie- en klaringsroutes en vermeende toxiciteit te bestuderen.